丙酮酸鈉減輕紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷及輸注后肝損傷的研究.pdf

1、紅細(xì)胞（red blood cell, RBC）是機(jī)體血液的主要組分，主要功能是運(yùn)輸氧氣和二氧化碳。臨床中，對(duì)于創(chuàng)傷或者術(shù)中大量出血的患者，輸血是一種基本的治療手段。臨床中患者輸注的紅細(xì)胞多為儲(chǔ)存紅細(xì)胞，醫(yī)院采用“先進(jìn)先出”的原則為患者輸血。紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中不可避免的發(fā)生一系列生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能變化，如能量代謝障礙、氧化應(yīng)激水平升高、細(xì)胞內(nèi)pH下降、紅細(xì)胞變形性及攜氧能力下降等，這些統(tǒng)稱(chēng)為“儲(chǔ)存損傷”。紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷可以導(dǎo)致紅細(xì)胞

2、回輸不良反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于新鮮紅細(xì)胞，儲(chǔ)存時(shí)間為7天的紅細(xì)胞變形性顯著下降，回輸后會(huì)加重失血性休克復(fù)蘇后急性肝損傷。另外，回輸紅細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致肺炎比格犬模型的死亡率增加。臨床研究中，在創(chuàng)傷、危重癥或圍術(shù)期等患者中，儲(chǔ)存紅細(xì)胞輸注與輸血相關(guān)急性肺損傷、多器官功能障礙及感染率和死亡率增加等不良反應(yīng)密切相關(guān)。
　　盡管大量研究揭示紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷與紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)密切相關(guān)，但是，儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的確切機(jī)制尚不明

3、確。目前有一氧化氮（Nitric oxide, NO）活性喪失、能量耗竭、游離血紅蛋白氧化損傷、變形性下降、鐵超載等多種假說(shuō)解釋紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生?；谝陨霞僬f(shuō)進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，吸入NO、洗滌紅細(xì)胞或復(fù)狀液處理儲(chǔ)存紅細(xì)胞等方法可以緩解或減少儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生。然而，以上方法大多是在紅細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷以后的補(bǔ)救措施，如果在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中，抑制紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷的發(fā)生，可能會(huì)獲得更大的治療益處。
　　根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督

4、管理局（FDA）標(biāo)準(zhǔn)，紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外儲(chǔ)存后溶血率應(yīng)小于1％，回輸至受體24小時(shí)后紅細(xì)胞的恢復(fù)率應(yīng)大于75%。紅細(xì)胞儲(chǔ)存后溶血率、存活率及儲(chǔ)存損傷與紅細(xì)胞保存液成分密切相關(guān)。自1915年，Rous和Turner首次將枸櫞酸和葡萄糖混合溶液用于紅細(xì)胞體外儲(chǔ)存以來(lái)，紅細(xì)胞保存液的組成不斷改進(jìn)。目前，臨床上4℃儲(chǔ)存紅細(xì)胞時(shí)間上限為42天，主要應(yīng)用CPDA-1、氯化鈉-腺膘呤-葡萄糖-甘露醇（SAGM）等紅細(xì)胞保存液保存紅細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改進(jìn)

5、紅細(xì)胞保存液的組成和理化性質(zhì)可以改善儲(chǔ)存紅細(xì)胞能量代謝，減輕儲(chǔ)存損傷，延長(zhǎng)了紅細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間。在儲(chǔ)存過(guò)程中，紅細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，添加能量代謝底物葡萄糖儲(chǔ)存紅細(xì)胞，可有效改善紅細(xì)胞能量代謝，降低儲(chǔ)存紅細(xì)胞溶血率。儲(chǔ)存過(guò)程中，紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力下降，氧自由基會(huì)直接氧化細(xì)胞膜及胞中關(guān)鍵蛋白，造成不可逆的氧化損傷，而目前紅細(xì)胞保存液中缺乏抗氧化成分。Stowell等發(fā)現(xiàn)，在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加抗氧化劑維生素C儲(chǔ)存紅細(xì)胞，盡管可有效提高儲(chǔ)存紅

6、細(xì)胞回輸存活率，并且降低免疫原性，但是研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加維生素 C儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸后并不能改善機(jī)體炎性反應(yīng)。一直以來(lái)對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷及其回輸不良反應(yīng)的研究從未停歇，但是紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生的儲(chǔ)存損傷仍未得到實(shí)質(zhì)性改善，并導(dǎo)致紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中，添加物質(zhì)可能改善紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷，降低回輸不良反應(yīng)。
　　丙酮酸鈉（sodium pyruvate,SP）是丙酮酸的鈉鹽。丙酮酸是糖代謝途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，既可

7、進(jìn)入三羧酸循環(huán)參與有氧代謝，生成二氧化碳、水，并產(chǎn)生能量，也可進(jìn)行無(wú)氧酵解轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔殡S產(chǎn)生能量。丙酮酸鈉具有抗氧化、抗炎、保護(hù)器官和糾正酸中毒等作用。已有研究表明，使用添加丙酮酸鈉的復(fù)狀液對(duì)儲(chǔ)存紅細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)能夠增加儲(chǔ)存紅細(xì)胞ATP和2,3-DPG的水平，改善紅細(xì)胞功能。然而，由于紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生不可逆的儲(chǔ)存損傷，因此在回輸前采用含有丙酮酸鈉成分的復(fù)狀液處理紅細(xì)胞不能完全逆轉(zhuǎn)儲(chǔ)存損傷。目前，在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉

8、對(duì)儲(chǔ)存紅細(xì)胞攜氧能力、氧化應(yīng)激水平等儲(chǔ)存損傷及回輸造成的不良反應(yīng)的影響未見(jiàn)報(bào)道。我們推測(cè)，在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉，可以有效改善紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷，減輕回輸不良反應(yīng)。
　　小鼠儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸模型是研究?jī)?chǔ)存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的常用動(dòng)物模型。研究表明，儲(chǔ)存14天的小鼠紅細(xì)胞和儲(chǔ)存42天的人類(lèi)紅細(xì)胞經(jīng)歷了相似的形態(tài)功能的變化，并且具有相似的生理生化狀態(tài)。因此，本研究擬用儲(chǔ)存14天的小鼠紅細(xì)胞模擬人類(lèi)儲(chǔ)存紅細(xì)胞，建立小鼠儲(chǔ)存紅細(xì)胞平臺(tái)，

9、研究丙酮酸鈉對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷的改善作用，并進(jìn)一步探討丙酮酸鈉在減輕儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)中的作用。
　　第一部分小鼠體外儲(chǔ)存紅細(xì)胞平臺(tái)的建立
　　本研究擬探討在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉對(duì)儲(chǔ)存紅細(xì)胞氧化應(yīng)激水平、攜氧能力等儲(chǔ)存損傷及回輸不良反應(yīng)的影響，首先需要建立小鼠體外儲(chǔ)存紅細(xì)胞平臺(tái)。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠（其注射量按75mg/kg體重計(jì)算），放于超凈工作臺(tái)中，用75%酒精消毒動(dòng)物手術(shù)區(qū)域及手術(shù)器械，同時(shí)機(jī)械通氣，通

10、過(guò)心臟穿刺取血，CPDA-1作為抗凝劑和儲(chǔ)存液，終濃度為14%，用白細(xì)胞濾器過(guò)濾去除全血中的白細(xì)胞，4℃條件下，400g離心15分鐘，去上清，調(diào)整紅細(xì)胞壓積為70-75%，血液保存冰箱4℃儲(chǔ)存。儲(chǔ)存時(shí)間小于2小時(shí)的作為新鮮紅細(xì)胞（FRBC），儲(chǔ)存時(shí)間為14天的作為儲(chǔ)存紅細(xì)胞（SRBC）。測(cè)定新鮮紅細(xì)胞和儲(chǔ)存紅細(xì)胞的血?dú)庵笜?biāo)，血常規(guī)指標(biāo)，紅細(xì)胞攜氧能力，紅細(xì)胞溶血率和24小時(shí)回輸存活率。
　　結(jié)果表明，相較于新鮮紅細(xì)胞，紅細(xì)胞在儲(chǔ)存

11、的過(guò)程中，紅細(xì)胞液中鈉離子濃度顯著降低，鉀離子濃度顯著升高（p＜0.05）。相較于新鮮紅細(xì)胞，紅細(xì)胞在儲(chǔ)存的過(guò)程中，溶血率顯著升高（p＜0.05），24小時(shí)回輸存活率顯著降低（p＜0.05），紅細(xì)胞P50值顯著降低（p＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中，紅細(xì)胞氧分壓下降，酸堿平衡受到破壞，紅細(xì)胞內(nèi)外鈉鉀離子分布異常，攜氧能力降低等。本部分研究成功建立了小鼠儲(chǔ)存紅細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為丙酮酸鈉在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中的作用評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)奠

12、定基礎(chǔ)。
　　第二部分丙酮酸鈉對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷保護(hù)作用的研究
　　本部分研究擬在第一部分構(gòu)建的小鼠儲(chǔ)存紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)基礎(chǔ)上，探究丙酮酸鈉在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷的保護(hù)作用。如第一部分所述方法制備去白全血，平均分2組（n=8）：1）丙酮酸鈉（Sodium pyruvate，SP）組，添加丙酮酸鈉濃縮液使儲(chǔ)存紅細(xì)胞中丙酮酸鈉的終濃度為2.5mM；2）對(duì)照（Control）組，按相同體積比加入等量的生理鹽水。離心，棄上清

13、以調(diào)整紅細(xì)胞壓積為70%-75%，4℃儲(chǔ)存14天后，測(cè)定紅細(xì)胞的血?dú)庵笜?biāo)、血常規(guī)指標(biāo)、攜氧能力、ATP水平、氧化應(yīng)激水平、溶血率和回輸24小時(shí)存活率。
　　結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，丙酮酸鈉組總血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積無(wú)顯著性差異；與對(duì)照組比較，丙酮酸鈉組儲(chǔ)存紅細(xì)胞 ATP含量顯著升高（p＜0.05），丙二醛（MDA）水平顯著降低（p＜0.05），超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高（p＜0.05），P50水平顯著升

14、高（p＜0.05）。與對(duì)照組相比較，丙酮酸鈉組儲(chǔ)存紅細(xì)胞溶血率有下降趨勢(shì)，回輸24小時(shí)存活率有升高趨勢(shì)，但兩組之間都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中，添加丙酮酸鈉對(duì)總血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積無(wú)明顯影響，但在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉能夠維持細(xì)胞內(nèi) ATP濃度和儲(chǔ)存紅細(xì)胞攜氧能力，提高儲(chǔ)存紅細(xì)胞抗氧化能力，減少紅細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。
　　第三部分丙酮酸鈉對(duì)儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸后肝損傷的影響

15、r>　　本部分以小鼠儲(chǔ)存紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為基礎(chǔ)，研究在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉對(duì)儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸造成的肝損傷的影響。如第二部分所述方法，制備添加丙酮酸鈉的儲(chǔ)存紅細(xì)胞及對(duì)照組儲(chǔ)存紅細(xì)胞。通過(guò)尾靜脈注射的方法，分別注射對(duì)照組和丙酮酸鈉組儲(chǔ)存紅細(xì)胞，注射量為小鼠總血量的20%，回輸2小時(shí)后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠（其注射量按75mg/kg體重計(jì)算），機(jī)械通氣，心臟穿刺取血，全血以6000rpm轉(zhuǎn)速離心90秒，取上層血漿并分裝，-80℃保存

16、。取肝臟組織，一部分放入液氮中保存，另一部分用4%多聚甲醛固定。測(cè)定小鼠血漿生化水平，主要有谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LDH），測(cè)定小鼠肝組織MDA水平，髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性，白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)HE染色，觀察小鼠肝組織病理變化。
　　結(jié)果表明，相較于對(duì)照組，丙酮酸鈉組小鼠血漿中AST活性顯著降低(p＜0.05)；BUN水平降低(p＜0.05

17、)；LDH活性降低(p＜0.05)。相較于對(duì)照組，丙酮酸鈉組小鼠肝組織MDA水平、MPO活性、IL-6和TNF-α水平都顯著性降低(p＜0.05)；病理組織結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，丙酮酸鈉組小鼠肝組織出現(xiàn)較少的細(xì)胞壞死灶和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中添加丙酮酸鈉，可顯著降低儲(chǔ)存紅細(xì)胞回輸造成的機(jī)體氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)水平升高，改善器官損傷。
　　綜上所述，本研究基于小鼠紅細(xì)胞儲(chǔ)存模型，評(píng)價(jià)紅細(xì)胞儲(chǔ)存過(guò)程中添