七氟醚損傷人紅細(xì)胞的體外研究.pdf

1、目的:近年的研究發(fā)現(xiàn),紅細(xì)胞數(shù)量、大小及功能改變是心血管疾病一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子。用七氟醚麻醉的患者術(shù)后外周血紅細(xì)胞數(shù)會(huì)降低,我們推測(cè)是由于七氟醚對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生損傷所致。紅細(xì)胞損傷后會(huì)出現(xiàn)兩種典型病理情況,即衰亡(eryptosis)和壞死(necrosis)。衰亡的紅細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬,使紅細(xì)胞壽命縮短,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起貧血,發(fā)生溶血壞死時(shí)釋放的游離血紅蛋白(freehemoglobin,FHB)會(huì)清除一氧化氮(NO)使血管系統(tǒng)等功能

2、受損,對(duì)組織器官十分有害?，F(xiàn)已證實(shí)紅細(xì)胞內(nèi)存在有活性的內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS),能催化精氨酸與瓜氨酸的轉(zhuǎn)換,并認(rèn)為紅細(xì)胞內(nèi)的NO主要依賴eNOS產(chǎn)生。紅細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的完整性極易受內(nèi)源性和外源性活性氧含量變化的影響,一直是實(shí)驗(yàn)室用于研究氧化損傷的理想而可靠的模型,我們利用該模型從紅細(xì)胞抗氧化能力、紅細(xì)胞NO代謝以及紅細(xì)胞衰亡三方面考察七氟醚對(duì)人紅細(xì)胞的影響,并探討其機(jī)制。
　　方法:第一部分:不同濃度的七氟醚對(duì)人紅細(xì)胞溶

3、血率及其抗氧化酶的影響。從健康志愿者全血提純紅細(xì)胞,制備成2％紅細(xì)胞懸液,使懸液含(mmol/l):氯化鈉145,氯化鉀4,氯化鈣2,葡萄糖5,PH=7.4。紅細(xì)胞懸液分成8組(n=4):空氣組(A),1%七氟醚組(S1)、3%七氟醚組(S3)、5%七氟醚組(S5),空氣+H2O2組(A+H組)、1%七氟醚+H2O2組(S1+H組)、3%七氟醚+H2O2組(S3+H組)、5%七氟醚+H2O2組(S5+H組),各組按上述濃度通醚,時(shí)間為3

4、0分鐘,孵育15小時(shí)后,過氧化氫組加入反應(yīng)濃度為200umol/L的過氧化氫,對(duì)照組加入等體積的林格氏液,各組繼續(xù)孵育3小時(shí)。應(yīng)用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞溶血率,委托北京華英生物技術(shù)研究室檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量。第二部分:不同濃度七氟醚對(duì)人紅細(xì)胞內(nèi)NO、NO2-、NO3-、iNOS和eNOS含量變化的影響。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置及通醚方案同第一部分,委托北京華英生

5、物技術(shù)研究室檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)NO、NO2-、NO3-、iNOS及eNOS的含量。第三部分:不同濃度七氟醚對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡的影響。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置:前8組設(shè)置同第一部分,增加以下8組:空氣+高糖組(A+G組)、1%七氟醚+高糖組(S1+G組)、3%七氟醚+高糖組(S3+G組)、5%七氟醚+高糖組(S5+G組),空氣+CaCl2組(A+C組)、1%七氟醚+CaCl2組(S1+C組)、3%七氟醚+CaCl2組(S3+C組)、5%七氟醚+CaC

6、l2組(S5+C組),各組通醚時(shí)間為30分鐘后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中50rpm,37℃孵育15小時(shí)后,分別加入反應(yīng)濃度為200umol/L的過氧化氫、反應(yīng)濃度為600mmol/L的葡萄糖溶液、反應(yīng)濃度為5mmol/L的氯化鈣,繼續(xù)孵育3小時(shí),應(yīng)用AnnexinV熒光染色檢測(cè)各組紅細(xì)胞PS標(biāo)記率及前向散射值(FSC)。
　　結(jié)果:第一部分:S3+H組溶血率(17.384±1.976)大于A+H組(10.848±0.274),P=0.0

7、07;S3+H組大于S3組(12.417±0.716),P=0.027。A組過氧化氫酶含量(17.301±4.222)大于S3組(5.431±0.531),P=0.009;A組大于S5組(5.175±0.658),P=0.009;過氧化氫酶含量S1+H組(4.319±0.235)、S3+H組(8.257±1.389)、S5+H組(9.156±0.742)均較A+H組(13.689±2.003)明顯降低(P<0.05)。S1+H組丙二醛含

8、量(3.547±0.898)大于A+H組(2.654±0.509),P-0.031;S3+H組(4.474±0.653)大于A+H組,P=0.021。GSH含量:S3組(6.266±0.254)大于S3+H組(6.097±0.322),P=0.018;A(7.335±0.106)大于S3,P=0.023;GSH-PX各組間均無顯著性差異。第二部分:NO含量:A組(3.199±0.208)小于A+H組(3.622±0.262),P=0.0

9、01;S1組(3.371±0.236)大于S1+H組(2.801±0.12),P=0.003;S3組(2.808±0.244)小于S3+H組(3.372±0.261),P<0.001;S5組(3.172±0.22)大于S5+H組(3.015±0.308),P=0.039;A+H大于SI+H,P=0.002;NO2-含量:A組(16.731±0.434)與A+H組(17.334±0.969),S1組(16.778±0.263)與S1+H組

10、(17.709±1.547),S5組(16.539±0.411)與S5+H組(16.397±0.35),均無顯著性差異,P>0.05;S3組(16.861±0.315)小于S3+H組(17.173±0.294),P=0.016;NO3-含量:A組(49.837±6.09)小于A+H組(65.000±4.173),P=0.002,;S1組(55.128±3.676)小于S1+H組(64.736±2.326),P=0.002;S5組(47.

11、233±4.886)小于S5+H組(57.526±2.148),P=0.005;S3組(55.779±11.342)與S3+H組(58.161±2.36)無顯著性差異,P=0.642;eNOS含量:A組(1.403±0.103)小于A+H組(1.62±0.117),P<0.001;S1組(1.503±0.107)小于S1+H組(1.23±0.075),P=0.002;S3組(1.256±0.112)小于S3+H組(1.508±0.122

12、),P<0.001;S5組(1.414±0.097)小于S5+H組(1.349±0.133),P=0.037;A+H組大于S1+H組,P=0.002;iNOS含量:A組(2.818±0.239)小于A+H組(3.215±0.224),P=0.001;S1組(3.002±0.208)大于S1+H組(2.495±0.106),P=0.003;S3組(2.495±0.209)小于S3+H組(2.984±0.216),P<0.001;S5組(2

13、.818±0.203)大于S5+H組(2.659±0.284),P=0.043;A+H組大于S1+H組,P=0.002.。第三部分:PS標(biāo)記率:A(1.28±0.62)小于S3(2.803±0.516),A小于S5(3.1775±0.474),S1(1.5925±0.167)小于S3,S1小于S5,P<0.05;A+H(1.47±0.337)小于S3+H(3.1325±0.223),A+H小于S5+H(3.605±0.622),S1+H

14、(2.225±0.357)小于S3+H,S1+H小于S5+H,P<0.05;前向散射值(FSC):A(1239.27±59.701)大于S3(1065.3125±14.607),A組大于S5組(1060.385±26.493),S1(1244.3±88.409)大于S3,S1大于S5,S3大于S5,P<0.05;A+H(1185.868±51.738)大于S5+H(1059.733±12.06),P=0.025。
　　結(jié)論:

15、>　　1、七氟醚可使人紅細(xì)胞抗氧化能力降低,表現(xiàn)為對(duì)活性氧(H2O2)損傷的抵抗能力降低,溶血率增加,MDA含量增高。其機(jī)制與抑制紅細(xì)胞過氧化氫酶活性、降低GSH含量有關(guān);
　　2、七氟醚抑制人紅細(xì)胞NO生成,表現(xiàn)為NO含量下降,降低紅細(xì)胞對(duì)活性氧(H2O2)應(yīng)激損傷的耐受性,其機(jī)制與抑制紅細(xì)胞內(nèi)eNOS及iNOS活性有關(guān),且iNOS的作用較eNOS顯著;
　　3、紅細(xì)胞內(nèi)存在有活性的eNOS及iNOS,且iNOS含量較高,