蛋白結(jié)合硫酸吲哚酚損傷紅細(xì)胞的研究.pdf

1、背景:
　　腎性貧血是指由于慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)而引起的貧血。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括促紅細(xì)胞生成素，即(Erythropoietin，EPO)的相對(duì)或絕對(duì)減少，尿毒癥毒素(Uremic toxins，UTox)導(dǎo)致骨髓生成紅細(xì)胞障礙和紅細(xì)胞破壞過多，出血，由于消化道癥狀導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不足、消化不良、吸收減少，甲狀旁腺功能亢進(jìn)導(dǎo)致骨髓病變等。腎性貧血是腎衰病人嚴(yán)重的并發(fā)癥，進(jìn)而引

2、起各系統(tǒng)缺血、缺氧[1-2]。長(zhǎng)期貧血會(huì)增加心臟負(fù)荷、引發(fā)心絞痛，慢性嚴(yán)重貧血時(shí)可引起心肌收縮力降低、射血分?jǐn)?shù)降低，繼而出現(xiàn)充血心力衰竭[3]。心力衰竭可以促使腎功能更進(jìn)一步惡化。貧血、腎衰、心衰這樣三種病理狀態(tài)，造成機(jī)體惡性循環(huán)，極度影響著病人生活的質(zhì)量和疾病的長(zhǎng)期預(yù)后[4]。因此，提高尿毒癥血透病人的生活質(zhì)量、降低并發(fā)癥、提高生存率，有效糾正貧血顯得尤為重要。
　　早在10年前Lang等提出紅細(xì)胞衰亡這一定義:許多因素可破壞紅

3、細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞自殺死亡或者衰亡，這種與有核細(xì)胞的凋亡類似的現(xiàn)象，由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核、細(xì)胞器、線粒體（這些可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入程序性凋亡），所以紅細(xì)胞不具有細(xì)胞凋亡的部分典型表現(xiàn)（譬如:核的濃縮、膜電位的消失），但是具備其他的凋亡特征（譬如:細(xì)胞皺縮、體積變小、膜囊泡化），體現(xiàn)在紅細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸，即（phosphatidylserine，PS）外露水平[5]。紅細(xì)胞膜表面外露程度的PS與機(jī)體的血紅蛋白間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[6-8]。以往

4、的研究表明，一些不同分子量的毒性物質(zhì)存在CKD病人血漿中，抑制骨髓生成紅細(xì)胞、破壞紅細(xì)胞而致使貧血[9]。如果將CKD病人的紅細(xì)胞輸給健康人，紅細(xì)胞生存時(shí)間會(huì)變?yōu)檎?，健康人紅細(xì)胞與尿毒癥病人血漿一起孵育時(shí)，紅細(xì)胞膜外面的PS顯著增加，細(xì)胞生存時(shí)間縮短[10]。這些研究結(jié)果證實(shí)，腎衰病人體內(nèi)的尿毒素在腎性貧血的發(fā)生機(jī)制中占非常重要的地位。血漿中某些因子與CKD病人紅細(xì)胞膜表面的PS相關(guān)聯(lián)[11-12]。Mario B等研究表明CKD晚期

5、未透析病人與血液透析病人比較紅細(xì)胞膜PS的外露水平?jīng)]有明顯區(qū)別，提示這些毒素不能為透析所清除，進(jìn)一步研究表明這些因子可能是不耐熱的大分子物質(zhì)或者蛋白質(zhì)，或者是具有高蛋白結(jié)合力的小分子物質(zhì)[12]。
　　各種血液凈化技術(shù)雖然緩解了多種尿毒癥毒素、水電解質(zhì)及酸堿失衡對(duì)生命的威脅，但均不能明顯地改善貧血，糾其原因大概是這些透析未能有效清除與蛋白結(jié)合的毒素。硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate，IS)，是一類尿毒癥毒素的典型代表，具

6、有與血漿白蛋白高度結(jié)合能力[13]，其在血漿中的結(jié)合系數(shù)是90％以上[14]，通過常規(guī)透析方法很難清除。CKD3-5期病人血清IS濃度是健康人的50-90倍[15]。近來(lái)蛋白結(jié)合尿毒癥毒素IS在CKD病人腎性貧血及其并發(fā)癥中所起的作用逐漸受到人們的關(guān)注。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)觀察白蛋白結(jié)合IS作用于紅細(xì)胞后的影響、探討其作用機(jī)制，從而探究白蛋白結(jié)合尿毒癥毒素IS與CKD病人腎性貧血相關(guān)關(guān)系。
　　方法:
　　本

7、課題按以下內(nèi)容進(jìn)行探討:
　　本研究采用非吸煙成年健康志愿者的外周靜脈血，以其離心后洗滌紅細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察4％蛋白結(jié)合的IS作用于人紅細(xì)胞48h后，檢測(cè)其對(duì)紅細(xì)胞體積(Forward scatter，F(xiàn)SC)、紅細(xì)胞外表面PS標(biāo)記率、溶血率、紅細(xì)胞內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度的影響。
　　1.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細(xì)胞PS標(biāo)記率和FSC的影響。
　　2.采用酶標(biāo)儀檢測(cè)4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細(xì)胞溶血率的

8、影響。
　　3.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)4％蛋白結(jié)合IS作用于紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的影響。
　　結(jié)果:
　　1.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細(xì)胞后，紅細(xì)胞FSC分別為1517.33±15.63、1489.66±8.02、1361.00±13.75、877.33±23.02、742.67±14.04,與4％白蛋白組相比，紅細(xì)胞體積隨IS濃度的增加而逐漸變小，并呈量效關(guān)系(

9、P＜0.05);而當(dāng)紅細(xì)胞外Ca2+陰性時(shí)，隨IS濃度的增加，細(xì)胞體積變小的程度明顯減輕。
　　2.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細(xì)胞后，紅細(xì)胞表面的PS標(biāo)記率分別為1.51±0.27％、1.73±0.23％、2.99±0.51％、4.78±0.36％、10.32±1.64％，與4％白蛋白組相比，隨蛋白結(jié)合IS濃度的增加，紅細(xì)胞外表面的PS標(biāo)記率漸增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05)

10、;而當(dāng)紅細(xì)胞外Ca2+陰性時(shí)，隨IS濃度的增加，紅細(xì)胞外表面的PS標(biāo)記率輕度的增加。
　　3.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細(xì)胞后，紅細(xì)胞溶血率分別為1.28±0.14％、2.55±0.29％、3.50±0.11％、4.70±0.23％、6.77±0.28％，紅細(xì)胞溶血率隨IS濃度的增加而逐漸增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05);細(xì)胞外Ca2+陰性時(shí)，隨IS濃度的增加，溶血率輕度的增

11、加。
　　4.蛋白結(jié)合(62.5、125、250、500、1000)μmol/LIS作用于人紅細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+平均熒光強(qiáng)度分別為6.04±0.70、6.87±0.77、8.72±0.55、9.94±0.47、12.03±0.50，紅細(xì)胞內(nèi)的Ca2+平均熒光強(qiáng)度隨IS濃度的增加而緩慢增加，并呈量效關(guān)系(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　4％白蛋白結(jié)合IS增加細(xì)胞外表面的PS標(biāo)記率、溶血率、細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度，能