sFRP5甲基化在硫酸吲哚酚誘導(dǎo)腎纖維化中的作用研究.pdf

1、腎纖維化是各種慢性腎臟病(Chronic Kideney Disease，CKD)發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病理基礎(chǔ)。腎纖維化以間質(zhì)纖維化和腎小管擴(kuò)張為特征，其嚴(yán)重程度與腎功能受損情況及患者腎臟疾病的預(yù)后有著非常密切的關(guān)系。截止目前，腎纖維化的發(fā)生機(jī)制并未完全闡明，因此，對該病理過程的深入研究具有非常重要的臨床意義。
　　腎纖維化的發(fā)生與發(fā)展與多種因素有關(guān)，如炎癥、氧化應(yīng)激等

2、，這些因素會導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞致纖維化因子分泌，造成腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)及成纖維細(xì)胞增殖與活化，最終導(dǎo)致腎纖維化。而尿毒癥毒素蓄積是CKD患者另一重要的臨床特征，近年來，人們開始關(guān)注尿毒癥毒素在CKD及其并發(fā)癥中的作用，特別是蛋白結(jié)合毒素，如硫酸吲哚酚(IS)，對甲酚硫酸鹽(PCS)，由于它們不能通過常規(guī)透析有效清除，可以在血液循環(huán)中長時間大量存在，對機(jī)體產(chǎn)生不良影響。晚近，我們和其他學(xué)者的研究均發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)合毒素IS可以促進(jìn)腎纖

3、維化，但截至目前，相關(guān)機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。
　　Wnt/β-catenin信號通路活化是導(dǎo)致腎纖維化的關(guān)鍵途徑之一。在正常機(jī)體中，Wnt/β-catenin信號通路處于沉默狀態(tài)，而腎臟損傷后，該通路被激活，使大量β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與TCF/LEF形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)，纖連蛋白，成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP1)，Snail1

4、，MMP-7等，最終導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展。而在IS誘導(dǎo)腎纖維化的過程中Wnt信號通路是否參與其中并不明確。既往研究表明，Wnt信號通路活化與否與其內(nèi)源性抑制因子有關(guān)，Wnt信號通路的內(nèi)源性抑制因子包括分泌型卷曲蛋白家族(secreatedfrizzled-related proteins，sFRPs)和清道夫受體家族(Diekkopfs，DKKs)。其中，sFRPs家族有5個成員，即sFRP1-5，sFRPs蛋白N-端的卷曲樣半胱氨

5、酸富集區(qū)域與Wnt特異性Frizzlrd受體有30％-50％序列相似，它可通過該區(qū)域與Wnt結(jié)合，或與Frizzlrd受體相互作用形成無功能的復(fù)合物，從而封閉Wnt信號通路。而sFRPs表達(dá)降低可引起Wnt信號通路持續(xù)激活，導(dǎo)致β-catenin在胞內(nèi)大量蓄積，進(jìn)而激活Wnt信號的下游靶基因。眾所周知，Wnt信號通路活化可以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，而sFRPs啟動子甲基化后的表達(dá)下調(diào)正是造成Wnt信號通路活化和癌癥進(jìn)展的重要機(jī)制之一。而引入關(guān)注

6、的是，在尿毒癥特有的內(nèi)環(huán)境下，蛋白結(jié)合毒素可以通過多種表觀遺傳修飾方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，DNA甲基化就是其中非常重要的一種表觀遺傳修飾方式，并且，有研究證實IS確實可以誘導(dǎo)某些基因發(fā)生甲基化。為此，我們將在本研究中明確IS促進(jìn)腎纖維化的作用是否與其誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路活化有關(guān)，并闡明sFRPs基因甲基化在此過程中是否發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并探討其中的可能機(jī)制，以期深入揭示腎纖維化的發(fā)生機(jī)理并為其防治提供新的干預(yù)靶點。
　　

7、為此，本研究首先觀察了CKD患者腎纖維化程度，IS血清濃度以及β-catenin表達(dá)之間的相關(guān)性;然后以人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）為體外研究對象，探討IS誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路激活的作用，并明確IS是否通過誘導(dǎo)sFRPs基因甲基化活化Wntβcatenin信號通路;最后，利用CD-1小鼠制備單側(cè)腎切除模型，觀察腹腔注射甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5Aza-2dc或sFRPs重組蛋白對小鼠腎纖維化的影響，明確外

8、源性補(bǔ)充sFRPs重組蛋白和甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑是否可以減輕IS誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化。
　　主要研究內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　1.CKD患者血清IS濃度與腎臟β-catenin表達(dá)，腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系;
　　34例患者的eGFR與血清IS濃度、β-catenin表達(dá)和腎間質(zhì)纖維化程度呈顯著負(fù)相關(guān)，即患者的eGFR越低，血清IS濃度和β-catenin的表達(dá)越高，腎間質(zhì)纖維化越重;相反，34例患者的血清IS濃度與β

9、-catenin表達(dá)、腎纖維化程度呈顯著正相關(guān);提示患者血清IS濃度與β-catenin表達(dá)和腎間質(zhì)纖維化程度有著密切關(guān)聯(lián)。
　　2.在單側(cè)腎切除CKD模型小鼠中，腹腔注射IS能夠誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化并激活Wnt/β-catenin信號通路;
　　IS注射組小鼠血清IS濃度較對照組小鼠血清IS濃度增高5倍;Masson染色顯示，與對照組相比，IS注射組小鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯增加;免疫組化和westem blot結(jié)果表明，與對照組

10、相比，IS注射組小鼠β-catenin和α-SMA表達(dá)顯著增加。上述結(jié)果表明，腹腔注射IS可以誘導(dǎo)單側(cè)腎切除小鼠腎間質(zhì)纖維化，該作用可能與其激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。
　　3.IS通過下調(diào)sFRP5表達(dá)激活Wnt/β-catenin信號通路;
　　IS對sFRP3和sFRP4 mRNA表達(dá)無明顯影響，sFRP1和sFRP2在HK-2細(xì)胞表達(dá)極弱，但sFRP5 mRNA表達(dá)隨著IS濃度的增加呈劑量依賴性降低;

11、western blot結(jié)果同樣表明，IS劑量依賴性的下調(diào)sFRP5表達(dá)。這說明IS可能通過抑制sFRP5表達(dá)激活了HK-2細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路。為了進(jìn)一步明確上述結(jié)論，我們在CKD患者腎活檢組織和腹腔注射IS的單側(cè)腎切除小鼠腎組織中觀察了sFRP5的表達(dá)情況，免疫組化染色結(jié)果表明，CKD5期患者腎臟sFRP5表達(dá)較正常腎臟組織明顯減弱。免疫組化、RT-PCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)腹腔注射IS的CKD小鼠腎

12、臟sFRP5 mRNA和蛋白表達(dá)較對照組明顯減弱。上述結(jié)果充分證實，IS通過下調(diào)sFRP5表達(dá)誘導(dǎo)了Wnt/β-catenin信號活化。
　　4.IS通過誘導(dǎo)sFRP5 DNA甲基化下調(diào)了sFRP5表達(dá)，導(dǎo)致了Wnt/β-catenin信號通路活化;
　　5.IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路誘導(dǎo)sFRP5 DNA甲基化;
　　眾所周知，IS能夠促進(jìn)多種細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是DNA啟動子CpG島發(fā)生甲基化

13、的一個主要誘發(fā)因素。為此，我們探討了IS是否是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并激活下游信號通路發(fā)揮致sFRP5 DNA甲基化的作用。DCFH-DA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS可呈時間和劑量依賴性促進(jìn)HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS生成;western blot結(jié)果顯示，IS劑量依賴性的誘導(dǎo)p-ERK1/2表達(dá)增高。而5 mM ROS清除劑NAC和10μM ERK1/2抑制劑U0126預(yù)孵育HK-2細(xì)胞1h，均可明顯抑制IS誘導(dǎo)的p-ERK1/2表達(dá)增高和sFRP5 DNA

14、啟動子甲基化。此外，NAC和U0126預(yù)孵育均能顯著抑制IS誘導(dǎo)的DNMT1蛋白表達(dá)增加和sFRP5蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果提示IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路，導(dǎo)致DNMT1表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)了sFRP5 DNA甲基化，從而下調(diào)了HK-2細(xì)胞sFRP5的表達(dá)。
　　6.外源性補(bǔ)充5Aza-2dc能夠明顯抑制IS誘導(dǎo)的CKD模型小鼠腎組織sFRP5 DNA甲基化程度及sFRP5表達(dá)下調(diào);
　　建立單側(cè)腎切除CKD小鼠模

15、型，腹腔注射IS的同時注射5Aza-2dc(0.35mg/kg/48h)，MSP檢測各組小鼠sFRP5 DNA甲基化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5Aza-2dc能夠顯著降低IS誘導(dǎo)的腎組織sFRP5 DNA甲基化程度。RT-PCR、免疫組化和western blot檢測結(jié)果顯示，5 Aza-2dc能夠抑制IS誘導(dǎo)的sFRP5表達(dá)下調(diào)。因此，我們的體內(nèi)研究進(jìn)一步證實，IS可以誘導(dǎo)sFRP5 DNA甲基化，而sFRP5 DNA啟動子甲基化很可能是IS誘

16、導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵機(jī)制。
　　7.腹腔注射sFRP5重組蛋白和5Aza-2dc明顯抑制了IS誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路活化及腎間質(zhì)纖維化。
　　為了明確sFRP5 DNA啟動子甲基化在IS誘導(dǎo)Wnt/β-eatenin信號通路活化和腎間質(zhì)纖維化中的作用，我們在給予CKD模型小鼠腹腔注射IS的同時注射不同濃度的sFRP5重組蛋白(0.02mg/kg/48h，0.01 mg/kg/48h)或5Aza-2dc(0.3

17、5 mg/kg/48h)，觀察Wnt/β-catenin信號通路的活化情況和腎纖維化程度。Masson染色結(jié)果表明，外源性補(bǔ)充sFRP5重組蛋白或5Aza-2dc均可不同程度的減輕IS誘導(dǎo)的模型小鼠腎間質(zhì)膠原沉積，免疫組化和western blot檢測發(fā)現(xiàn)纖維化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)也明顯降低。此外，外源性補(bǔ)充sFRP5重組蛋白或5Aza-2dc均可顯著抑制IS誘導(dǎo)的β-catenin表達(dá)增高。我們分析認(rèn)為，外源性補(bǔ)充sFRP5重組蛋白或

18、者抑制sFRP5 DNA啟動子甲基化均可削弱IS誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號活化，改善腎間質(zhì)纖維化。因此，sFRP5啟動子甲基化是IS誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　綜上所述，本研究表明，IS通過激活ROS/ERK1/2信號通路，誘導(dǎo)了sFRP5 DNA啟動子甲基化，導(dǎo)致sFRP5表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而活化Wnt/β-catenin信號，最終促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。而外源性補(bǔ)充sFRP5重組蛋白或者使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑