ELMO1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟病進展的共同通路是進展性腎小管間質(zhì)纖維化。腎小管間質(zhì)纖維化的組織病理學特征是與炎癥細胞相關(guān)的間質(zhì)基質(zhì)的沉積、腎小管細胞的減少、成纖維細胞的聚積和小管周圍微脈管系統(tǒng)的稀疏。細胞外基質(zhì)的過度沉積，尤其是膠原纖維，是腎小管間質(zhì)纖維化的最顯著特征。
　　 盡管有許多導致纖維化的因子，包括多種細胞因子和激素/代謝及血流動力學因素，TGF-β1及其信號通路是腎臟纖維化的關(guān)鍵分子通路?；罨霓D(zhuǎn)化生長因子-β(

2、TGF-β)與其受體結(jié)合，以自分泌和旁分泌的方式通過Smad依賴和非依賴性信號傳導通路來發(fā)揮生物學及病理學作用。TGF-β1與其Ⅱ性受體(TβRⅡ)結(jié)合能激活TGF-βⅠ型受體(TβRⅠ)-激酶，導致Smad2和Smad3(兩種受體相關(guān)性Smads(R-Smads))磷酸化。隨后，磷酸化的Smad2和Smad3與相同的Smad4結(jié)合，形成Smad復(fù)合物，進而轉(zhuǎn)位于細胞核中，調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。多種促進纖維化的基因、如Ⅰ型膠原(colla

3、genⅠ)、Ⅲ型膠原(collagenⅢ)和MMP-1的組織抑制劑（TIMP-1）均為TGF-β/Smad信號通路的下游，表明Smad3是纖維化中TGF-β/Smad信號通路關(guān)鍵介質(zhì)。細胞對TGF-β反應(yīng)是具有高度細胞類型特異性的。Smads的DNA結(jié)合親和力相對較弱。因此，最終的轉(zhuǎn)錄結(jié)果決定于同其他轉(zhuǎn)錄因子、輔助激活劑和輔助抑制劑的相互作用。而且越來越多證據(jù)支持TGF-β也激活非smad信號通路:如Rac1、TAK1（TGFβ相關(guān)激酶

4、1）、ERK1/2（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶）、p38MPAK、JNK、Wnt/β-catenin、ROS、NF-KB及Akt等多條信號通路。非經(jīng)典信號通路可能以組織甚至細胞特異性方式與Smad信號通路相互影響。TGF-β可以通過由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-Rac1介導的信號通路增加Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。TGF-β信號通路似乎是許多其他致纖維化因素效應(yīng)直接或間接整合，進而匯聚成的共同信號通路。其中像血管緊張素Ⅱ和高糖，是TGF-β的上游誘導

5、劑，而像結(jié)締組織生長因子則是其下游效應(yīng)劑。
　　 Racl是小鳥甘三磷酸酶（小GTP酶）的Rho家族的成員之一。Rac1廣泛表達，以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，一種是失火的GDP結(jié)合形式，另一種是活化的GTP結(jié)合形式。在細胞外信號的作用下，Rac1通過鳥苷酸交換因子(GEFs)轉(zhuǎn)變成其活化形式。而通過GTP酶激活蛋白轉(zhuǎn)化為失活形式。研究發(fā)現(xiàn)在人的腎小管上皮細胞中TGF-β1可以通過活化Rac1增加CollagenⅠ的合成。另外，活化的Ra

6、c1還具有增加基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的合成和分泌、活化NF-κB以及促進β-catenin核轉(zhuǎn)位的作用。而且，在缺氧環(huán)境下，活化的Rac1可以誘導細胞生成ROS。而ROS可以誘導致纖維化反應(yīng)。特異性敲除成纖維細胞Rac1的小鼠的皮膚傷口閉合延遲，膠原合成及肌成纖維細胞形成減少。在Rac1敲除的成纖維細胞中α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達下降。這表明Rac1與腎臟纖維化密切相關(guān)。
　　 DOCK180是一種進化上保守的蛋白，D

7、OCK180與另一種進化上保守的蛋白—吞噬和細胞運動性蛋白1(ELMO1)形成復(fù)合物，作為Rac的GEF，特異性激活Rac，參與了細胞遷移和吞噬凋亡細胞過程中細胞骨架的改變。ELMO能通過避免DOCK180被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解而大大地促進DOCK180蛋白在細胞內(nèi)聚集。ELMO還能促進DOCK180與Rac在細胞膜上共定位，因而間接地增強RacGEF的活性。
　　 ELMO1基因的單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病易于罹患糖尿病腎病

8、有關(guān)。
　　 正常小鼠腎臟中，ELMO1主要在腎小管及腎小球上皮細胞弱表達。而糖尿病小鼠腎臟和慢性腎炎的大鼠模型的腎臟中則明顯升高。高糖條件下培養(yǎng)的COS細胞中ELMO1的表達高于正常糖條件下表達。而過表達ELMO1的細胞中collagenⅠ和fibronectin基因表達與正常細胞相比也是升高的。而collagenⅠ是纖維化的重要指標，那么ELMO1是否在腎臟間質(zhì)纖維化中發(fā)揮了作用呢？
　　 此外，上述研究也表明ELM

9、O1介導了高糖誘導的collagenⅠ和fibronectin的表達。而Rac1作為ELMO1的直接下游，也介導了TGF-β1誘導的collagenⅠ的表達。而高糖是TGF-β的上游誘導劑，那么TGF-β1對Rac1的活化是否是通過ELMO1介導的呢？
　　 圍繞上述問題，本研究選擇大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型作為腎間質(zhì)纖維化模型，觀察ELMO1的表達及分布。并用NRK-52E作為腎小管上皮細胞模型，觀察TGF-β刺激后，E

10、LMO1的表達變化，并過表達及沉默ELMO1，進一步觀察其對Rac1活性、collagenⅠ的影響。目的在于探討ELMO1在腎間質(zhì)纖維化中的作用及其可能機制，為臨床治療提供新的干預(yù)靶點。
　　 實驗方法：
　　 1.大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型制作
　　 雄性SD大鼠24只，體重250-280g，假手術(shù)(Sham)組6只，UUO模型組18只。制作UUO模型制作，每日常規(guī)給予大鼠飼料和飲用水，術(shù)后3、7和14天

11、模型組各處死6只，Sham組于第14天處死。取左側(cè)腎臟的1/2用中性甲醛固定，脫水和石蠟包埋，做常規(guī)病理染色和免疫組化，1/2用液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80。C保存，備蛋白提取。
　　 2.大鼠腎組織中ELMO1、collagenⅠ、α-SMA的蛋白表達水平
　　 Westernblotting檢測sham組、UUO3天、7天、14天組大鼠腎組織中ELMO1、collagenⅠ、α-SMA的蛋白表達水平。
　　 3.檢

12、測大鼠腎組織中ELMO1mRNA
　　 4.檢測大鼠腎組織中ELMO1的表達和分布。
　　 免疫組化檢測sham組、UUO7天組大鼠腎組織中ELMO1的表達和分布
　　 5.細胞培養(yǎng)
　　 NRK52E細胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，95％空氣，5％CO2。
　　 6.TGF-β1對NRK52E細胞表達ELMO1mRNA的影響
　　 7.TGF-β

13、1對NRK52E細胞表達ELMO1和collagenⅠ的影響
　　 以適當比例接種子35mm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到60％融合，換成無血清培養(yǎng)基，同步化24小時后一組細胞換成含0、1、2、5、10ng/mlTGF-β1的無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)48小時?；?0ng/mlTGF-β1的無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0、24、48、72小時WesternBlotting檢測ELMO1和collagenⅠ。
　　 8.過表達ELMO1對于c

14、ollagenⅠ表達的影響
　　 NRK52E細胞以適當比例接種于35mm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到60％融合，用OPTI-MEM稀釋的空載體pcDNA3.1(N)或pcDNA3.1/ELMO1與lipofectamine2000(每個35mm的皿中pcDNA3.1/ELMO12μg，lipofectamine20005μl)混勻后，轉(zhuǎn)染5個小時，吸取換成10％血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時，靜置12小時后，加入或不加入TGF-β110n

15、g/ml刺激48小時。
　　 WesternBlotting檢測ELMO1、collagenⅠ的表達
　　 9.過表達ELMO1對于Rac1活性的影響
　　 NRK52E細胞以適當比例接種于35mm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到60％融合，用OPTI-MEM稀釋的空載體pcDNA3.1(N)或pcDNA3.1/ELMO1與lipofectamine2000（每個35mm的皿中pcDNA3.1/ELMO12μg，lipo

16、fectamine20005μl混勻后，轉(zhuǎn)染5個小時，吸取換成10％血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時，轉(zhuǎn)染后48小時使用WesternBlot檢測檢測TotalRac1，使用Pulldown實驗和WesternBlot檢測ATP-Rac1。
　　 8.ELMO1siRNA對于Rac1活性的影響
　　 NRK52E細胞以適當比例接種于35mm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞達到60％融合，用OPTI-MEM稀釋的NCsiRNA或ELMO1siR

17、NA與lipofectamine2000（每個35mm的皿中NCsiRNA或ELMO1siRNA100pmol，lipofectamine20005μl）混勻后，轉(zhuǎn)染5個小時，吸取換成10％血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時，轉(zhuǎn)染后48小時使用WesternBlot檢測檢測TotalRac1，使用Pulldown實驗和WesternBlotATP-Rac1。
　　 9.統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果，以均數(shù)±

18、標準差表示，所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。當方差齊時，多個樣本均數(shù)的比較采用One-WayANOVA，兩兩比較采用LSD，當方差不齊時使用Welch檢驗，兩兩比較采用Dennett’sT3。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一.腎組織病理HE染色顯示UUO第七天腎小管明顯擴張，腎間質(zhì)中見大量炎癥細胞浸潤。
　　 二.模型大鼠腎組織ELMO1mRNA

19、水平表達升高
　　 RealtimePCR方法檢測UUO第七天與sham組腎組織的ELMO1mRNA水平。結(jié)果顯示:ELMO1的表達在兩組間有統(tǒng)計學差異，采用兩樣本t檢驗，方差不齊(F＝9.622，P=0.027)，t=-7.356P=0.001，UUO組是Sham組的2.5±0.33倍。
　　 三.UUO模型大鼠腎組織ELMO、collagenⅠ及α-SMA蛋白水平表達升高，且ELMO1主要定位于腎小管上皮細胞中。

20、r>　　 Westernblot方法檢測UUO及Sham組大鼠腎組織的ELMO1、collagenⅠ、α-SMA的表達。結(jié)果顯示，ELMO1、collagenⅠ、α-SMA在各個組間差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.174;collagenⅠP=0.167;α-SMAP=0.102)，采用方差分析，ELMO1F=139.315，P＜0.001;collagenⅠF=21.052，P＜0.001;a-SMAF＝74.619，P

21、＜0.001。在UUO模型第三天ELMO1、collagenⅠ、α-SMA與Sham組相比均升高，其中ELMO1是Sham組的3.1±0.33倍(P＜0.001);collagenⅠ是Sham組的1.7±0.54倍(P＜0.05);α-SMA是Sham組的19.8±1.88(P＜0.001)。隨著輸尿管梗阻時間的延長，大鼠腎組織ELMO1蛋白的表達繼續(xù)增高，在第7天即UUO模型組的ELMO1是Sham組的4.4±0.48倍(P＜0.00

22、1);collagenⅠ是Sham組的2.0±0.33倍(P＜0.05);α-SMA是Sham組的19.9±2.40(P＜0.001)。在第十四天，ELMO1、collagenⅠ和α-SMA繼續(xù)升高，ELMO1是Sham組的8.3±0.67倍(P＜0.001);collagenⅠ是Sham組的3.2±0.30倍(P＜0.001);α-SMA是Sham組的23.7±2.75(P＜0.001)。
　　 免疫組織化學結(jié)果也顯示，UUO

23、組第7天ELMO1的表達高于Sham組，且ELMO1大多定位于近端腎小管細胞中。
　　 四.TGF-β1作用不同時間對NRK52E細胞ELMO1、Collagen1表達的影響用10ng/mlTGF-β刺激0h、24h、48h、72h后提取總蛋白進行Westernblot檢測ELMO1和collagenⅠ。結(jié)果顯示，ELMO1、collagenⅠ在不同時間點的表達差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.455;collagen

24、ⅠP=0.495;)，采用方差分析，ELMO1F=40.027,P＜0.001;collagenⅠF=176.200,P＜0.001。TGF-β刺激24h與0h相比，ELMO1和collagenⅠ的表達均升高，其中ELMO1是0h組的2.4±0.15倍(P＜0.001);collagenⅠ是0h組的3.3±0.14倍(P＜0.001)。TGF-β刺激48h與0h相比，ELMO1和collagenⅠ的表達仍升高，其中ELMO1是0h組的2

25、.4±0.26倍(P＜0.001);collagenⅠ是0h組的3.6±0.26倍(P＜0.001)。TGF-B刺激72h與0h相比，ELMO1和collagenⅠ的表達仍然升高，其中ELMO1是0h組的2.5±0.16倍(P＜0.001);collagenⅠ是0h組的4.2±0.20倍(P＜0.001)。
　　 五.不同濃度TGF-β1對NRK52E細胞ELMO1、Collagen1表達的影響用0、1、2、5、10ng/mlT

26、GF-β刺激48h后提取總蛋白進行Westernblot檢測ELMO1和collagenⅠ。結(jié)果顯示，ELMO1、collagenⅠ在不同濃度組建的表達差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.491;collagenⅠP＝0.516;)，采用方差分析，ELMO1F=127.342,P＜0.001;collagenⅠF=96.221,P＜0.001。TGF-β刺激1ng/ml與0ng/ml相比，ELMO1和collagenⅠ的表達均升

27、高，其中ELMO1是0ng/ml組的1.9±0.28倍(P＜0.001);collagenⅠ是0ng/ml組的1.7±0.15倍(P=0.008)。TGF-β刺激2ng/ml與0ng/ml相比，ELMO1和collagenⅠ的表達仍升高，其中ELMO1是0h組的3.7±0.11倍(P＜0.001);collagenⅠ是0ng/ml組的2.5±0.23倍(P＜0.001)。TGF-β刺激5ng/ml與0ng/ml相比，ELMO1和coll

28、agenⅠ的表達仍然升高，其中ELMO1是0ng/ml組的3.9±0.30倍(P＜0.001);collagenⅠ是0h組的3.0±0.37倍(P＜0.001)。TGF-β刺激10ng/ml與0ng/ml相比，ELMO1和collagenⅠ的表達仍然升高，其中ELMO1是0ng/ml組的4.0±0.17倍(P＜0.001);collagenⅠ是0h組的4.5±0.25倍(P＜0.001)。
　　 六.TGF-β1作用不同時間對N

29、RK52E細胞ELMO1mRNA表達的影響用10ng/mlTGF-β刺激0、1、2、3、6、12、24、36小時后提取RNA進行realtimePCR檢測ELMO1mRNA。結(jié)果顯示，ELMO1mRNA不同時間點的表達差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.109)，采用方差分析，ELMO1F=74.994，P＜0.001。TGF-β刺激1、2h與0h相比，ELMO1mRNA無統(tǒng)計學差異。TGF-β刺激3h與0h相比，其中ELMO1

30、是0h組的1.7±0.15倍(P＜0.001)。TGF-β刺激6h與0h相比，ELMO1的表達繼續(xù)升高，其中ELMO1是0h組的2.3±0.20倍(P＜0.001)。TGF-β刺激12h與0h相比，ELMO1仍然升高，其中ELMO1是0h組的3.7±0.15倍(P＜0.001)。TGF-β刺激24、36h，ELMO1顯著下降，與0h相比，無統(tǒng)計學差異。
　　 七.過表達ELMO1對于CollagenⅠ的表達的影響
　　

31、在NRK52E細胞中過表達ELMO1，分別在pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的(N)的和過表達ELMO1（ELMO1-wt）的細胞中加或不加10ng/ml的TGF-β刺激48h。結(jié)果在各組間ELMO1、collagenⅠ的表達差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.108;collagenⅠP=0.052;)，采用方差分析，ELMO1F=43.255，P＜0.001;collagenⅠF=100.333，P＜0.001。ELMO1-wt組與N組

32、相比，其中ELMO1的表達是N組的9.5±1.35倍(P＜0.001)，說明過表達ELMO1是成功的，collagenⅠ表達水平與N組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.092)，表明單純過表達ELMO1，并不能引起collagenⅠ的升高。N+TGF-β組的collagenⅠ的表達是ctrl組的4.6±0.83倍(P＜0.001);而ELMO1-wt+TGF-β組是N組的9.5±0.93倍(P＜0.001)。這表明過表達ELMO1能進一步促

33、進TGF-β引起的collagenⅠ的表達。
　　 八.ELMO1siRNA對于CollagenⅠ的表達的影響
　　 在NRK52E細胞中沉默ELMO1，分別向ELMO1siRNA的細胞或陰性對照細胞(NCsiRNA)的細胞中加或不加10ng/ml的TGF-β刺激48h。結(jié)果在各組間ELMO1、collagenⅠ的表達差異有統(tǒng)計學意義。方差齊(ELMO1P=0.346;collagenⅠP=0.082;)，采用方差分析，

34、ELMO1F＝71.620，P＜0.001;collagenⅠF=68.057，P＜0.001。ELMO1siRNA組+TGF-β1與NCsiRNA+TGF-β1組相比，其中ELMO1的表達是NCsiRNA+TGF-β1組的0.49倍(P＜0.001)，說明ELMO1沉默是有效的，collagenⅠ表達水平與NCsiRNA+TGF-β1組組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，collagenⅠ的表達是NCsiRNA+TGF-β1組的

35、0.53倍，表明沉默ELMO1，能抑制TGF-β誘導的collagenⅠ的升高。
　　 九.過表達ELMO1對Rac1活性的影響
　　 在NRK52E細胞中過表達ELMO1，過表達ELMO1(ELMO1-wt)的細胞或空載體轉(zhuǎn)染的對照細胞(N)培養(yǎng)48h后檢測Rac1活性。應(yīng)用pulldown及westernblot方法檢測NRK52E細胞Rac1的活性的改變。結(jié)果見，ELMO1的表達在兩組間有統(tǒng)計學差異，采用兩樣本t檢

36、驗，方差齊(F=5.781，P=0.074)，t＝-5.324P＜0.05，ELMO1-wt組是N組的4.4±1.11倍。說明過表達ELMO1是成功的。Rac1的活性在兩組間有統(tǒng)計學差異，采用兩樣本t檢驗，方差齊(F=7.268，P＝0.054)，t＝-5.790，P＜0.05，ELMO1-wt組是N組的3.5±0.75倍。這表明ELMO1在NRK52E細胞中過表達ELMO1可誘導Rac1的活化。
　　 十.沉默ELMO1對Ra

37、c1活性的影響
　　 在NRK52E細胞中用ELMO1siRNA沉默ELMO1，ELMO1siRNA的細胞或陰性對照細胞(NCsiRNA)中培養(yǎng)48h后檢測Rac1活性。應(yīng)用pulldown及westernblot方法檢測NRK52E細胞Rac1的活性的改變。結(jié)果顯示，ELMO1的表達在兩組間有統(tǒng)計學差異，采用兩樣本t檢驗，方差齊(F=1.467，P=0.292)，t=10.290，P＜0.05，ELMO1siRNA組與NCsi

38、RNA比較下降了53.2％。說明ELMO1siRNA是有效的的。Rac1的活性在兩組間有統(tǒng)計學差異，采用兩樣本t檢驗，方差不齊(F=0.738，P=0.439)，t=10.735P＜0.05，ELMO1siRNA組與NCsiRNA比較下降了66％。這表明沉默ELMO1能抑制活化Rac1
　　 結(jié)論：
　　 一.本研究成功建立了在腎間質(zhì)纖維化模型UUO大鼠模型。
　　 二.發(fā)現(xiàn)ELMO1在UUO大鼠腎組織表達明顯升