嗜酸乳桿菌S層蛋白抗病毒感染特性研究.pdf

1、目前益生菌抗病毒作用的存在已被廣大學者所了解，其菌群中特別是嗜酸乳桿菌具有較明顯的抗致病微生物性質(zhì)。本實驗研究嗜酸乳桿菌S層蛋白在抗病毒作用中參與的程度以及作用原理，建立適合研究益生菌的原代腸上皮細胞為平臺對嗜酸乳桿菌抗病毒的效果和S層蛋白在抗病毒作用中參與的程度做相關(guān)研究，以期為益生菌的后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。
　　 實驗首先對嗜酸乳桿菌的S層蛋白進行基因和蛋白提取鑒定，實驗結(jié)果顯示菌體存在S層蛋白基因大小為1200bp，

2、使用中性LiC1提取菌體S層蛋白后利用SDS-PAGE分析所提蛋白大小為45ku且蛋白純度較高，與文獻報道一致。蛋白純化后制備抗S層蛋白兔多克隆血清抗體，經(jīng)Elisa方法檢測血清抗體效價為1.0×105，能夠滿足實驗后續(xù)要求。對于雞腸上皮細胞的原代培養(yǎng)，選用20日齡即將出殼的SPF雞胚，使用刮取法獲得腸絨毛和隱窩單位，使用膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅳ聯(lián)合消化后放入預先鋪有膠原蛋白的96孔細胞培養(yǎng)板里，按照一定的細胞接種密度，兩個雞胚可以鋪滿一塊96

3、孔細胞板，使用與成纖維細胞共同培養(yǎng)的方法進行IEC培養(yǎng)。
　　 為了評價S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中參與抗病毒的程度，設置以下實驗組:組1將菌體不同成分先接觸IEC，共同孵育1h使其充分作用，使用緩沖液洗去其他成分后加入病毒孵育1h，再洗去病毒成分，加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)細胞，直至病毒對照組出現(xiàn)細胞病交(CPE)為止，停止細胞培養(yǎng)，進行MTT檢測細胞活力;組2先加入病毒，后加入菌體各個成分，具體步驟同上;組3將菌體成分與病毒

4、先孵育1h后一同加入細胞中三者共同孵育1h，之后洗去成分加入細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，直至病毒對照組出現(xiàn)細胞病變(CPE)為止，停止細胞培養(yǎng)，進行MTT檢測細胞活力。
　　 實驗結(jié)果顯示，S層蛋白對病毒抑制性最強，菌體其次，脫S層蛋白菌體次之，代謝產(chǎn)物抑制病毒率最低。S層蛋白之所以高于嗜酸乳桿菌的病毒抑制率，因在IEC可承受范圍內(nèi)其蛋白濃度大于嗜酸乳桿菌中菌體表面的S蛋白含量，故在抑制率的數(shù)值上比菌體作用明顯;脫S層蛋白菌體和全菌體相

5、比，前者抑制率低于后者，可見，在菌體抑制病毒作用中S層蛋白起了明顯作用;從代謝產(chǎn)物的病毒抑制率來看，菌體的次級代謝產(chǎn)物仍有一定的抗病毒性質(zhì)。通過與其他成分的比較可見，菌體對病毒的抑制作用是多方面共同發(fā)揮的結(jié)果，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發(fā)揮了不可忽視的作用。
　　 4種菌體成分的組1和組3實驗中兩種病毒抑制率都高于組2實驗，說明當病毒感染細胞，益生菌成分無法起到明顯的抑制病毒增殖作用。組1實驗與組3實驗相比，不同成分有所差

6、別。對于S層蛋白，先加蛋白，后加病毒時，蛋白才能阻止其感染細胞，病毒感染細胞后再加入S蛋白幾乎沒有明顯效果。這意味著S層蛋白只能在病毒感染前期起到抗病毒感染作用，這說明S層蛋白具有預防病毒感染效果;而當病毒感染細胞后，S層蛋白對已受病毒侵染的細胞卻沒有治療效果，可見，S層蛋白發(fā)揮抗病毒作用的時期為病毒入侵細胞之前。菌體最高的病毒抑制率出現(xiàn)在組3和組1組中，菌體的組2病毒抑制率明顯高于S蛋白組、脫S菌體組和代謝產(chǎn)物組，說明菌體的綜合抗病毒

7、能力強于各自成分，并對以感染病毒的IEC有一定的保護作用。
　　 為了進一步研究S層蛋白與病毒之間的作用關(guān)系進行下列實驗。實驗1借鑒間接ELISA方法檢測病毒與S層蛋白的粘附性，選擇牛血清白蛋白作為陰性對照;實驗2評價牛血清白蛋白有無病毒抑制性，方法同S層蛋白的病毒抑制實驗。實驗結(jié)果顯示，S層蛋白與白蛋白都能粘附IBV和NDV，但是只有S蛋白對病毒具有顯著的抑制性，白蛋白沒有明顯的抑制性，說明S層蛋白對病毒的粘附確實影響并阻礙了

8、病毒對腸上皮細胞的感染，具有抑制IBV和NDV感染IEC的能力。
　　 綜上所述，菌體對病毒的抑制作用是多方面共同發(fā)揮的結(jié)果，S層蛋白在嗜酸乳桿菌抗病毒作用中發(fā)揮了明顯作用。進一步研究S層蛋白與病毒之間的作用關(guān)系實驗結(jié)果說明S蛋白對病毒的粘附作用起到了抑制病毒感染的效果，產(chǎn)生的S蛋白-病毒復合體阻礙了病毒對IEC的感染。目前對于S層蛋白的研究還有大量的工作要做，本研究僅對益生菌中嗜酸乳桿菌S層蛋白在雞原代腸上皮細胞中進行的抗病毒