CILP2誘導(dǎo)THP1源性泡沫細(xì)胞形成.pdf

1、本研究分為四部分：
　　第一部分：人CILP2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
　　目的:構(gòu)建人pIRES2-EGFP-CILP2-Flag質(zhì)粒
　　方法:提取HEK293細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA，高保真酶PCR獲取CILP2-Flag基因片段，經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切，連接重組至pIRES2-EGFP空載質(zhì)粒上。雙酶切和基因測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建效果。
　　結(jié)果:BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝

2、膠電泳，在約3.5kb和5.3kb處出現(xiàn)條帶，初步鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast對比分析，核酸序列與GenBank中CILP2 CDS區(qū)序列同源性完全一致，且C端正確帶上Flag片段。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-CILP2-Flag標(biāo)簽質(zhì)粒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分：cilp2基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)分布和不同病理模型中的表達(dá)差異
　　目的:檢測cilp2基因在正常

3、C57BL/6J小鼠體內(nèi)的mRNA表達(dá)分布，以及在ApoE-/-小鼠和冠心病人中的mRNA和蛋白表達(dá)差異。
　　方法:取普食喂養(yǎng)C57BL/6J12周齡雄性小鼠3只脫頸處死，留取心，肝，脾，胃，肌肉，腦，腎，肺組織，提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR測定cilp2表達(dá)分布;取C57BL/6J和ApoE-/-12周齡雄性小鼠，取主動脈和冠狀動脈組織，提取mRNA和蛋白，分別用RT-PCR和western blot方法檢測c

4、ilp2表達(dá);取冠心病人和正常人骨骼肌組織，提取mRNA和蛋白，RT-PCR和western blot方法檢測CILP2表達(dá)差異;重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
　　結(jié)果:cilp2在小鼠肌肉中表達(dá)較高，其后依次是心臟、大腦、腎臟、肺、胃、脾、肝臟和小腸;ApoE-/-小鼠肌肉、主動脈和冠狀動脈組織cilp2含量較C57BL/6J小鼠明顯增高;冠心病人骨骼肌中CILP2表達(dá)較正常人明顯增高。
　　結(jié)論:cilp2在動脈粥樣硬化疾病模型中表達(dá)

5、顯著升高，可能在動脈粥樣硬化形成過程中產(chǎn)生影響。
　　第三部分：CILP2分泌蛋白的驗(yàn)證
　　目的:驗(yàn)證CILP2為分泌蛋白。
　　方法:分別用pIRES2-CILP2-Flag質(zhì)粒和pIRES2-EGFP空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48h，提取胞內(nèi)蛋白和上清培養(yǎng)液。用anti-Flag M2親和磁珠免疫沉淀蛋白，western blot檢測目的蛋白。各取三人300ul血漿，PBS稀釋30倍，10％ SDS-PAGE

6、凝膠做western blot檢測人血漿中CILP2含量，以及正常人和冠心病人血漿中CILP2表達(dá)差異。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染CILP2-Flag質(zhì)粒的細(xì)胞上清中含有CILP2蛋白;人血漿中含有CILP2蛋白;冠心病人血漿中CILP2蛋白含量顯著高于正常人。
　　結(jié)論:CILP2是一種分泌蛋白，在冠心病人血漿中含量高于正常人。
　　第四部分：CILP2對THP1源性泡沫細(xì)胞形成的作用
　　目的:探討CILP2對泡沫細(xì)胞

7、形成的影響和可能機(jī)制。
　　方法:oxLDL作用于THP1巨噬細(xì)胞，RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CILP2mRNA隨oxLDL作用時間和劑量的變化;將CILP2腺病毒感染THP1巨噬細(xì)胞48h，RT-PCR方法檢測清道夫受體(SR-AI，CD36，CD68，LOX-1)，TF，PAI-1 mRNA的表達(dá)變化;在oxLDL存在下，感染CILP2腺病毒，油紅O檢測THP1巨噬細(xì)胞甘油三酯聚集情況。
　　結(jié)果:THP1巨噬細(xì)胞內(nèi)CILP

8、2 mRNA表達(dá)隨oxLDL作用劑量和時間增加而增加，分別在20ug/ml和24h表達(dá)量達(dá)到最高;感染CILP2腺病毒48h后，細(xì)胞內(nèi)CILP2 mRNA和蛋白水平顯著升高(p＜0.05），清道夫受體SR-AI，CD68 mRNA較對照組有顯著升高(p＜0.05）;CD36、LOX-1、TF和PAI-1 mRNA改變沒有顯著差異;油紅O染色顯示，在oxLDL存在下，感染CILP2腺病毒細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集明顯增高(p＜0.05)。