中棉所36花發(fā)育均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST分析.pdf

1、分類號(hào)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中棉所36花發(fā)育均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST分析ConstruetionofNormal撫edeDNALibraryandAnalysisonExPressedSequenceTagso仃heFlowerDeveloPmentofCCRI36碩士研究生:劉俊杰指導(dǎo)教師:喻樹(shù)迅研究員指導(dǎo)小組:喻樹(shù)迅研究員范術(shù)麗副研究員宋美珍副研究員專業(yè):作物遺傳育種研究方向:棉花遺傳育種獲得學(xué)位名稱:農(nóng)學(xué)碩士獲得學(xué)位時(shí)間:

2、2008年6月20日華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院二00八年六月華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆碩[學(xué)位論文2.3CDNA的合成.................................................................................................……212.3.1合成cDNA第一鏈..............................................

3、...……212.3.2cDNA擴(kuò)增(Long一distancePCR，LD一PCR)........................................……222.4cDNA的均一化...............................................................................……222.4.1特異降解雙鏈DNA酶(DSN)的稀釋................

4、..................................……222.4.2DsN活性檢測(cè)..................................................................................……222.4.3準(zhǔn)備用于均一化的雙鏈cDNA...............……，...........................................……23

5、2.4.4雜交.............................................................................................................……232.4.5DSN處理..........................................................................................

6、...........……242.4.6對(duì)DSN處理的樣品進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增.............................................……252.4.7對(duì)DSN處理的樣品進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增.............................................……262.5蛋白酶處理...................................................

7、.................................................……262.6sfil酶處理...........................................................……272.7用ChromaSPIN一400將cDNA按分子大小分級(jí)分部............................……272.8處理后dscDNA與載體pDNR一LIB連接.....

8、............................................……282.9連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(以下操作均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行)....................................……292.10均一化文庫(kù)滴度檢測(cè)..................................................................................……292.n均一化文庫(kù)插

9、入片斷長(zhǎng)度檢測(cè)..................................................................……302.12cDNA均一化效果分析...............................................................................……302.12.1虛擬Nthemblot(VirtualNthemblot)..........

10、....................................……303實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析................................................……343.1總RNA的提取...........................................................……343.2mRNA的分離.....................................

11、.........................……353.3mRNA反轉(zhuǎn)錄成全長(zhǎng)cDNA.........................................................................……363.4均一化...........................................................................................

12、................……363.4.1全長(zhǎng)cDNA的均一化................................................................................……363.4.2均一化cDNA的第二次擴(kuò)增....................................................................……373.5用ChromaS

13、PIN一400將cDNA按分子大小分級(jí)分部.............................……383.6克隆數(shù)目和重組率的鑒定............................................................................……383.7插入片斷長(zhǎng)度的檢測(cè)............................................................

14、.....................……393.8均一化cDNA文庫(kù)的均一化效果分析.......................................................……404討論.................................................................................................................

15、.....……414.1取樣.................................................................................................................……414.2棉花總RNA的提取.......................................……414.3mRNA的純化及反轉(zhuǎn)錄....................

16、............................................................……424.4均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)................................................................................……424.5DSN法與其它均一化方法的比較........................................