油桐種子EST文庫構建及FAD2等重要基因全長cDNA克隆.pdf

1、油桐是我國特有的木本油料樹種，所產(chǎn)桐油經(jīng)濟價值特高，廣泛應用于高級油漆、涂料、油墨等制造業(yè)，又可供制生物柴油、樹脂、人造橡膠、皮革、塑料、顏料及醫(yī)藥等。油桐種質資源是我國特有的基因資源，在基因表達水平開展對油桐品質及產(chǎn)量形成相關基因的研究，對油桐分子育種具有重要的理論意義和實踐價值。本文以油桐對年桐品種為試材，構建種子cDNA文庫、EST文庫，并對EST序列進行全面分析，對重要基因全長cDNA克隆等方面進行了研究，主要結果有:
　

2、　 (1)油桐近成熟種子cDNA文庫的構建。采用Unizol方法提取總RNA，經(jīng)OligotexmRNAkit分離并純化得到mRNA，在SuperSciptTMⅡRnaseH-ReverseTranscriptase等的作用下合成cDNA，與pBluescriptⅡSK(+)XR載體連接重組并轉化感受態(tài)細胞DH10B，成功地構建了油桐對年桐近成熟種子的cDNA文庫。文庫總容量為8.53×106，重組率為88.95％，插入片段長度500

3、-1500bp。構建的文庫質量高，為進一步建立油桐EST文庫、開展基因分離鑒定、制作油桐基因芯片和基因表達檢測等奠定了良好基礎。
　　 (2)油桐近成熟種子EST文庫的構建。以構建的油桐對年桐近成熟種子cDNA文庫為材料，隨機挑選3203個陽性克隆進行5'端測序，獲得了具代表性的表達序列標簽(EST)。經(jīng)分析、整理，獲得3202有效EST序列，平均長度554bp，500-700bp的ESTs占73.6％;在線CAP3拼接，共獲得

4、876個非冗余基因序列，其中重疊群202，單一EST序列674。重疊群的EST拷貝數(shù)從2個到106個不等，拷貝數(shù)為2的最多，達81個;拷貝數(shù)為3的有29個;拷貝數(shù)7個以上的出現(xiàn)頻率多為1或2。油桐對年桐品種的EST文庫系國內首次構建，為油桐功能基因組及遺傳改良等的進一步研究提供了資源基礎。
　　 (3)油桐EST序列功能注釋。3202個有效EST序列中，1954個為功能已知基因序列，423個為功能未明確的基因序列，760個為相似

5、性較低的基因序列，44個為沒有重要相似性的基因序列，21個非植物類基因序列。1954個功能已知的基因序列中，非冗余基因序列467個，包括重疊群序列176個，單一序列291個，涉及379種功能基因;其中與油桐本種同源的序列133個，與同屬千年桐同源的序列349個;與大戟科變葉木等11種植物同源的序列1347個。與其他科屬植物同源的序列125個。
　　 (4)油桐種子EST文庫已知功能基因表達分析。油桐近成熟種子表達的379個已知功

6、能基因歸為物質代謝、能量代謝、細胞生長發(fā)育、轉錄、蛋白質合成、蛋白質定位與貯藏、載體、細胞結構、信號轉導、抗病與防衛(wèi)、次生代謝及未分類基因等12大類，蛋白質合成相關基因的表達最豐富，占49.6％，蛋白質定位與貯藏蛋白相關基因占21.9％，抗病和防衛(wèi)相關基因占8.1％;其他各類的相關基因表達量均不足5％。說明材料采集時油桐種子正處蛋白質合成與貯藏高峰期。其中與脂肪酸代謝相關的功能基因有△12油酸脫飽酶(FAD2)、β-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ

7、(KASI)、烯脂?；；d體蛋白還原酶(EAR)、參與檸檬酸穿梭的蘋果酸脫氫酶、2，4-二烯脂酰CoA還原酶、3-酮脂酰輔酶A硫解酶、脂肪酸β-氧化多功能蛋白等，其中△12油酸脫飽酶(FAD2)基因屬高豐度表達。與油脂貯藏相關的油體蛋白Oleosin基因高豐度表達。與貯藏蛋白相關的基因有蛋白A3前體、豆球蛋白B前體、(11)S球蛋白β亞基前體、豆球蛋白類蛋白、種子貯藏蛋白等，多為高豐度表達。與抗性相關的基因35種，主要有金屬硫蛋白、熱

8、激蛋白、親環(huán)素、脫水素、翻譯控制腫瘤蛋白、富含脯氨酸蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶等高豐度表達的基因。與能量代謝相關的基因主要有果糖二磷酸醛縮酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸葡萄糖變位酶、二氫硫辛酰胺脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶等低豐度表達的基因。與蛋白質合成相關基因64種，主要有18S核糖體RNA、26S核糖體RNA、小亞基核糖體RNA、30S核糖體蛋白、40S核糖體蛋白、50S核糖體蛋白、60S核糖體蛋白、翻譯起始因子等;與氨基酸代謝相關的

9、序列4條。與蛋白質結構相關基因17條，主要有前折疊素相關蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶、泛素等。與信號轉導相關的基因序列32條，涉及23種功能基因。與基因轉錄相關的基因序列36條，涉及24種功能基因。與次生代謝相關基因23種44條序列。與物質轉運相關基因序列23條。
　　 (5)油桐FAD2基因的全長cDNA克隆。所克隆的FAD2基因序列長1537bp，含長度為1146bp的完整編碼序列，編碼383個氨基酸。其氨基酸序列有3個多變區(qū)，

10、N端的起始段6個氨基酸為信號肽序列，3個組氨酸簇高度保守。酶蛋白分子量44144.4Da，等電點pI8.57，有5個跨膜結構域，說明FAD2為膜結合酶，在N端、C端及中間各有一強親水區(qū)，為膜外結構區(qū);中間若干區(qū)段為疏水區(qū)，為膜內結構區(qū)，組氨酸簇位膜表面，二級結構中α螺旋主要位于肽鏈C端，β折疊鏈較短，卷曲主要位于肽鏈N端。
　　 (6)油桐核糖體蛋白及rRNA基因的全長cDNA克隆。60S核糖體蛋白L8的基因序列長1086bp，

11、含有長783bp的完整編碼序列，編碼261個氨基酸。氨基酸序列近N端和近C端高度保守，C端尾部變化較大。酶蛋白分子量28175.3Da，pI11.44，為堿性蛋白。N端、C端各具強親水性，中間則親水區(qū)與疏水區(qū)相間。二級結構上，卷曲主要位于肽鏈的中部，β折疊鏈較短，α螺旋較少，主要位于N端和C端。18SrRNA基因序列全長2523bp，26SrRNA基因序列長2933bp。不同產(chǎn)地和不同生存環(huán)境的物種，其rRNA基因有不同的堿基組成，親緣

12、關系越近的物種間堿基相似性越大，構建rRNA基因進化樹是檢測物種基因同源性和鑒別物種有力的輔助工具。26SrRNA和18SrRNA分別參與到核糖體大小亞基的自組裝形成中，rRNA分子內有大量的反向互補序列，形成大量局部雙鏈區(qū)并自卷曲和折疊而形成穩(wěn)定的“莖環(huán)狀”結構。rRNA分子結構有大量鏈內雙鏈區(qū)，雙鏈間有較小的內凸環(huán)，側凸環(huán)成鏈的拐點，較大環(huán)則成為雙鏈定向的環(huán)島，雙鏈末端為發(fā)夾結構，呈長臂狀的“吸臂”，這有利于rRNA分子與核糖體蛋白