油桐種子轉(zhuǎn)錄組解析及油脂合成重要基因克隆.pdf

1、油桐原產(chǎn)中國(guó)，與油茶、核桃、烏桕并稱我國(guó)四大木本油料植物，其種子可用來(lái)制取桐油，曾經(jīng)是一種世界最著名的制造高檔油漆和油墨的優(yōu)質(zhì)原料，也是制造生物柴油的重要原料，還是制造新型復(fù)合功能材料的重要原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。研究油桐種子中油脂合成的機(jī)理不僅能為木本植物油脂積累的研究奠定重要的理論基礎(chǔ)，還可能利用克隆的重要基因?qū)τ屯┻M(jìn)行分子遺傳改良，從而大幅度提高桐油的單位面積產(chǎn)量，提高桐油品質(zhì)及其對(duì)不良環(huán)境的抗逆能力。以往的研究大都集中于傳

2、統(tǒng)的栽培和育種方面，相關(guān)的分子生物學(xué)研究還不夠深入，沒(méi)有涉及到基因的功能研究，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)油桐遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和育種學(xué)的種種需求。造成這一局限性的原因是缺少有用的參考基因序列信息。本研究利用Illumina測(cè)序技術(shù)分別在6月、8月、10月對(duì)油桐處于不同發(fā)育時(shí)期種子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)3個(gè)不同時(shí)期種子的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析、基因表達(dá)差異分析、和油脂合成代謝等代謝途徑解析;在此基礎(chǔ)上，對(duì)FATA基因和KASⅢ基因進(jìn)行了基因克隆和功能研究，

3、主要研究結(jié)果如下:
　　1、油桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的序列組裝、基因功能注釋和分類。對(duì)Ⅰ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中52，039，198個(gè)clean reads進(jìn)行組裝后獲得98，909個(gè)contigs和61，001個(gè)Unigene，其中長(zhǎng)度在75-200nt范圍內(nèi)的Contig片段有54，918條。對(duì)Ⅱ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中51，886，702個(gè)clean reads進(jìn)行組裝后獲得87，848個(gè)contigs和54，679個(gè)Unigene，其中長(zhǎng)度在75-

4、200nt范圍內(nèi)的Contig片段有47，735條。對(duì)Ⅲ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中52，734，436個(gè)clean reads進(jìn)行組裝后獲得69，253個(gè)contigs和44，495個(gè)Unigene，其中長(zhǎng)度在75-200nt范圍內(nèi)的Contig片段有34，274條。對(duì)相關(guān)cDNA序列進(jìn)行基因注釋，共有41，059條Unigene序列能夠與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因匹配，占所有非冗余基因的70.3％。3個(gè)不同時(shí)期的油桐種子轉(zhuǎn)錄組共有26，625條Uni

5、gene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有同源性，這些Unigene根據(jù)預(yù)測(cè)的功能可分為25類。GO分類將油桐3個(gè)轉(zhuǎn)錄組的30，280個(gè)非冗余Unigene(占Unigene總數(shù)的51.8％)歸類于61個(gè)組。KEGG的PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)油桐種子油脂合成不同時(shí)期的3個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳細(xì)的解析，將非冗余基因歸于128個(gè)代謝途徑。
　　2、油桐種子油脂合成代謝途徑基因表達(dá)模式解析。將油桐種子3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行兩兩比較后，對(duì)差異表

6、達(dá)Unigene進(jìn)行GO分析并分別歸類于57(Ⅱ vsⅠ)、59(Ⅲ vsⅡ)和61(Ⅲ vsⅠ)個(gè)組，同時(shí)將獲得的差異表達(dá)Unigene分別歸于126(Ⅱ vsⅠ)、127(Ⅲ vsⅡ)和127(Ⅲ vsⅠ)個(gè)代謝途徑。對(duì)3個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Pathway富集性分析發(fā)現(xiàn)共有54個(gè)Unigene可歸類于脂肪酸生物合成途徑，占所有非冗余Unigene的0.24％。將54個(gè)Unigene序列在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后獲得14個(gè)與其它物種同

7、源的脂肪酸合成相關(guān)基因并對(duì)這些基因在油桐油脂合成期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。對(duì)3個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Pathway富集性分析發(fā)現(xiàn)共有428個(gè)Unigene可歸類于甘油磷脂代謝途徑，占所有非冗余Unigene的1.93％。將428個(gè)Unigene序列在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后獲得31個(gè)與其他物種同源的甘油磷脂代謝相關(guān)基因并對(duì)這些基因在油桐油脂合成期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。
　　3、油桐FATA基因的克隆與功能研究。通過(guò)RACE技術(shù)克隆了長(zhǎng)

8、度為1480 bp的油桐FATA基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并在此基礎(chǔ)上利用PCR技術(shù)克隆了FATA基因的CDS序列和基因組序列，長(zhǎng)度分別為1113 bp和3801 bp。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，油桐FATA蛋白質(zhì)序列與其它植物的FATA序列之間具有較高的同源性，這證實(shí)了我們克隆出的基因確實(shí)是油桐的FATA基因。系統(tǒng)演化分析發(fā)現(xiàn)，油桐FATA與麻風(fēng)樹FATA的親緣關(guān)系最近，其次是蓖麻（Ricinus communis）FATA，而與蒺藜狀苜蓿FA

9、TA的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過(guò)Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATA基因在油桐基因組中以單拷貝形式存在。油桐FATA基因在根、葉和種子中都有表達(dá)，其中在葉、子葉和幼根中的表達(dá)量無(wú)明顯差異，而在種子中，表達(dá)量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，且在Ⅰ期即油脂剛開始合成時(shí)的表達(dá)量高于葉、子葉和幼根中的表達(dá)量。利用TAIL-PCR技術(shù)克隆了油桐FATA基因的啟動(dòng)子，為后續(xù)基因的表達(dá)調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4、油桐KASⅢ基因的克隆與功能研究。同樣，通過(guò)

10、RACE技術(shù)克隆了長(zhǎng)度為1651 bp的油桐KASⅢ基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，油桐KASⅢ蛋白質(zhì)序列與其它植物的KASⅢ序列之間具有較高的同源性。系統(tǒng)演化分析發(fā)現(xiàn)，油桐KASⅢ與麻風(fēng)樹和蓖麻KASⅢ的親緣關(guān)系較近。表達(dá)模式研究表明，油桐KASⅢ基因在根、葉和種子中都有表達(dá)，其中在葉、子葉和幼根中的表達(dá)量無(wú)明顯差異，而在種子中，表達(dá)量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，且在Ⅰ期即油脂剛開始合成時(shí)的表達(dá)量高于葉、子葉和幼根中的表達(dá)量。<