肝損傷萃取物對(duì)不同物種BMSCs分化方向的影響及微囊包被技術(shù)初探.pdf

1、干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是當(dāng)前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。骨髓間質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的均質(zhì)性成體干細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下可向不同胚層的細(xì)胞分化，如：骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。近年來(lái)，向肝系細(xì)胞分化的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)的前期研究已成功實(shí)現(xiàn)了由骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，證實(shí)了肝損傷組織萃取物對(duì)骨髓干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)活性，并初步揭示了肝損傷組織萃取物的分子基礎(chǔ)。研究顯示，肝損傷組織萃取

2、物內(nèi)可能包含有骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化所需的信息分子。然而，上述研究都是以大鼠模型為基礎(chǔ)的，研究發(fā)現(xiàn)的大鼠肝損傷組織萃取物的生物學(xué)活性是否對(duì)其他物種也起作用?換言之，大鼠肝損傷組織萃取物的干細(xì)胞定向誘導(dǎo)活性是否具有物種廣譜性?對(duì)于評(píng)估肝損傷組織萃取物的潛在應(yīng)用價(jià)值以及是否有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的必要性，無(wú)疑具有十分重要的意義。 如上所述，我們已實(shí)現(xiàn)了由骨髓間質(zhì)細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明這些骨髓源肝細(xì)胞能夠代償衰竭的肝

3、臟功能，可作為細(xì)胞移植和生物反應(yīng)器研制的細(xì)胞源。然而，如何解決免疫隔離問(wèn)題則是我們必須跨越的技術(shù)屏障。文獻(xiàn)分析顯示，ACA微囊比較適合細(xì)胞移植和生物反應(yīng)器對(duì)免疫隔離的要求。因此，能否利用海藻酸鈉和殼聚糖等材料成功地制作出ACA微囊、微珠等細(xì)胞載體?能否實(shí)現(xiàn)微囊/微珠與細(xì)胞的成功結(jié)合?如何提高微囊/微珠內(nèi)細(xì)胞的存活率并保持其生物活性?若能解決這一系列技術(shù)問(wèn)題，對(duì)于細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展及生物反應(yīng)器的研制無(wú)疑具有十分重要的意義?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)

4、狀以及本研究組前期的工作結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠肝損傷組織萃取物分別對(duì)源自大鼠、人和新西蘭兔的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，以觀察不同物種來(lái)源的細(xì)胞對(duì)大鼠肝損傷組織萃取物的應(yīng)答能力，從而判斷大鼠肝損傷組織萃取物對(duì)骨髓間質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)活性是否具有物種廣譜性。同時(shí)，為了解決細(xì)胞移植所引起的免疫隔離問(wèn)題我們初步探索了．ACA微囊/微珠技術(shù)，為細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展及生物反應(yīng)器的研制做必要的準(zhǔn)備。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、肝損傷萃取物對(duì)不同物種BMS

5、Cs分化方向的影響： 1.肝損傷大鼠模型的構(gòu)建及肝組織萃取物的制備選取SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以2-AAF/CCl4程序構(gòu)建肝損傷動(dòng)物模型。取動(dòng)物肝臟，制備肝組織萃取物。 2.肝組織萃取物生物活性的鑒定以肝組織萃取物作為刺激物對(duì)大鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)BMSCs誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)特征以及分子表達(dá)譜特征(分化狀態(tài))確認(rèn)肝組織萃取物的生物活性。 3.三個(gè)物種BMSCs的獲取和培養(yǎng)。

6、4.利用同批次相同誘導(dǎo)強(qiáng)度的肝損傷萃取物誘導(dǎo)液同時(shí)對(duì)三個(gè)不同物種的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。 5.分別在第5、7、10和20天收集誘導(dǎo)中的細(xì)胞，并拍照記錄下不同時(shí)間的形態(tài)特征。 6.利用RT—PCR技術(shù)分析不同物種在不同誘導(dǎo)時(shí)間的分子表達(dá)譜。 二、微囊包被技術(shù)初步探索： 1.利用自制微囊制備儀制備微載體，在倒置相差顯微鏡下觀察微載體的形態(tài)。 2.掃描電鏡觀察微球和微珠表面超微結(jié)構(gòu)。 3.嘗試

7、模擬滾動(dòng)培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)載細(xì)胞微珠，并觀察不同培養(yǎng)方式下微珠內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)活性和細(xì)胞形態(tài)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.三個(gè)物種BMSCs在誘導(dǎo)過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化十分相似。在誘導(dǎo)的第5天見(jiàn)一部分短梭形細(xì)胞變?yōu)轭悎A形細(xì)胞(圖3—4)，且細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢；誘導(dǎo)第10天，類圓形細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切晤惿掀有螒B(tài)，細(xì)胞灶狀分布逐漸凸顯，導(dǎo)第20天，灶狀分布的類上皮樣細(xì)胞十分明顯，呈簇狀緩慢生長(zhǎng)，中央?yún)^(qū)域細(xì)胞多角形明顯(人BMSCs變化更為明顯)。

8、 2.大鼠、人和新西蘭兔BMSCs在肝損傷組織萃取物的誘導(dǎo)下第5天開(kāi)始表達(dá)幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)記M2-PK和GST-P，而在繼續(xù)誘導(dǎo)第20天幼稚肝細(xì)胞的標(biāo)記消失，同時(shí)大鼠BMSCs轉(zhuǎn)而開(kāi)始表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記Albumin；在第10、20天骨髓源性標(biāo)記BST-1逐漸消失。這種分化跡象從始至終在對(duì)照組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，并始終保持骨髓源細(xì)胞特有的標(biāo)志分子BST-1。注：新西蘭兔則因基因信息缺乏致數(shù)據(jù)缺失。 3.微珠/微囊大小均一、平均直徑為0

9、.8mm左右，規(guī)則圓形，表面光滑，透明，并具有一定強(qiáng)度；載細(xì)胞微珠形態(tài)大小和表面結(jié)構(gòu)與空載微珠完全相同，但微珠內(nèi)可見(jiàn)分布均勻的細(xì)胞；載細(xì)胞微囊為大小均勻，平均直徑約為1m，規(guī)則圓形，囊壁完整；培養(yǎng)24h后載細(xì)胞微囊內(nèi)壁可見(jiàn)貼壁細(xì)胞貼于微囊囊壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)活性和培養(yǎng)瓶二維培養(yǎng)細(xì)胞基本相同。 4.掃描電鏡示：500倍下微球表面凹凸不平伴有圓形突起，突起之間的平坦區(qū)為表面平滑的皺褶，100000倍下皺褶表面平滑。殼聚糖外膜

10、的微珠500倍下可見(jiàn)粗糙表面伴有凹凸不平的球形隆起，100000倍下每個(gè)大顆粒表面為分布均勻的形狀大小均細(xì)的珊瑚狀或小顆粒結(jié)構(gòu)組成。 5.微珠在靜置培養(yǎng)5天后仍保持一定存活率，同種培養(yǎng)方式下，細(xì)胞存活率的下降趨勢(shì)是固定的，滾動(dòng)培養(yǎng)在短時(shí)間內(nèi)可以保持較高的存活率；使用培養(yǎng)基更適合做靜置培養(yǎng)。載細(xì)胞微囊靜置培養(yǎng)10天后仍保持較強(qiáng)存活率。 結(jié)論： 1.使用大鼠肝損傷萃取物同時(shí)對(duì)大鼠、人和新西蘭兔BMSCs的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

11、，三個(gè)物種的BMSCs均能對(duì)大鼠肝損傷萃取物的誘導(dǎo)刺激作出應(yīng)答反應(yīng)，分別在刺激的第5，7，10天表達(dá)幼稚肝細(xì)胞的分子標(biāo)志M2-PK和GST-P(新西蘭兔BMSCs僅表達(dá)M2-PK)。表明大鼠肝損傷萃取物對(duì)骨髓干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)活性具有物種廣譜性，有必要進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。 2.由于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)參數(shù)是依據(jù)大鼠設(shè)定，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的第20天，僅見(jiàn)大鼠BMSCs表達(dá)albumin，人BMSCs未見(jiàn)表達(dá)，可能與刺激強(qiáng)度不足或刺激時(shí)間不夠所致。

12、新西蘭兔則因albumin基因信息缺乏致數(shù)據(jù)缺失。 3.以自制微囊制備儀制作的海藻酸鈉微球、ACA微珠和ACA微囊直徑在0.8mm左右，大小均一，形狀規(guī)則，超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)明顯，初步達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。 4.ACA．微珠/微囊與細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞能在微珠內(nèi)存活7天左右而在微囊可以存活10天以上。表明ACA微珠和微囊具有較好的半透性，可作為細(xì)胞載體。 5.自制微囊制備儀制作的ACA微珠和微囊直徑偏大，表面積較小，距實(shí)際應(yīng)