微囊藻毒素暴露及谷胱甘肽基因多態(tài)性與兒童肝損傷關(guān)系.pdf

1、近年來，藍(lán)藻水華日趨頻繁，產(chǎn)生了大量對人類健康有極大危害的微囊藻毒素(Microcystins, MCs)。研究表明MCs 主要產(chǎn)生肝毒性，長期慢性暴露甚至可以導(dǎo)致肝癌。早期研究主要集中在MCs的毒效應(yīng)及其損傷機(jī)制等方面，而對人群尤其是兒童的健康效應(yīng)研究不多。目前國內(nèi)外尚無MCs 所致肝損傷的易感性生物標(biāo)志物研究，因此篩選和保護(hù)對MCs 所致肝損傷有易感性的人群具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 MCs是由淡水藻類銅綠微囊藻產(chǎn)生的一類具

2、有生物活性的環(huán)狀七肽，目前已發(fā)現(xiàn)80余種亞型，其中MC-LR 毒性最大，研究最多。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase, GSTs)是一組具有解毒功能的蛋白超基因家族，是體內(nèi)對外來物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒酶。MCs通過飲水途徑進(jìn)入人體內(nèi)后，由肝細(xì)胞內(nèi)GSTs 進(jìn)行解毒后，與體內(nèi)的谷胱甘肽(Glutathione, GSH)共軛結(jié)合，然后轉(zhuǎn)至腎臟和大腸排出體外。

3、根據(jù)底物特性、DNA 序列同源性、免疫學(xué)性質(zhì)等，人類不同GSTs 被分為GSTA1(Alpha-1)、GSTM1(Mu-1)、GSTP1(Pi-1)和GSTT1(Theta-1)等。其中GSTM1、GSTT1是最重要的兩種，分別位于1p13.3，22q11.23，均存在缺失基因型，表現(xiàn)為基因部分和全部缺失。這兩種基因缺失型個體產(chǎn)生GSTs的數(shù)量和活性大小存在差異，導(dǎo)致個體對MCs 具有不同的解毒能力。
　　 本研究第一部分采用現(xiàn)

4、況調(diào)查方法，以重慶市涪陵區(qū)兒童為研究對象，通過檢測其MCs內(nèi)外暴露水平和人群問卷調(diào)查，篩選出MCs 暴露致肝損傷的人群，以探討MCs暴露與肝損傷的關(guān)系。第二部分采用病例-對照研究方法，在MCs 暴露人群中篩選出因MCs 致肝損傷的人群和肝功能正常的人群，分別檢測兩組人群外周血細(xì)胞GSTM1和GSTT1基因型表達(dá)頻率，尋找人群對MCs 致肝損傷的易感性生物標(biāo)志物。
　　 研究內(nèi)容：
　　 一、兒童MCs內(nèi)外暴露與肝損傷的關(guān)

5、聯(lián)性研究
　　 1.現(xiàn)況調(diào)查本研究以重慶市涪陵區(qū)為研究現(xiàn)場，采用整群抽樣的方式，隨機(jī)選取涪陵區(qū)5 所中小學(xué)共1441名兒童為研究對象，通過問卷調(diào)查方法收集人群年齡、飲用水來源、飲水量和既往病史等一般特征信息。
　　 2.三種飲用水來源
　　 當(dāng)?shù)貎和嬘盟腥N，一是井水，井水中未曾檢測出MCs；二是湖一水，該湖雖然存在MCs 污染，但均在國標(biāo)飲用水MCs 限值1μg (MC-Lreq)/L 以內(nèi)；三是飲用湖二水

6、，該湖MCs 污染比較嚴(yán)重，2008年水中MCs 高達(dá)4.3μg (MC-Lreq)/L，是國標(biāo)飲用水MCs 限值的4倍。因此，我們推測該地區(qū)存在MCs 暴露不同程度的人群，是開展水環(huán)境中MCs 暴露及人群健康損害評價的較好現(xiàn)場。根據(jù)問卷調(diào)查的結(jié)果，將整個人群分為MCs 高、低暴露組以及對照組三組。
　　 3.MCs內(nèi)外暴露水平檢測
　　 2005-2009年，每年10月采集涪陵區(qū)兩湖及井水水樣，并于2009年10月捕獲

7、兩湖中的6種水產(chǎn)品(5種魚類和1種鴨類)，同時抽取每名兒童3ml 靜脈血。上述水樣、水產(chǎn)品以及血樣經(jīng)過萃取和純化等前期處理后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測以上樣本中MC-LR濃度。
　　 4.肝功酶檢測
　　 2009年10月抽取每名兒童3ml 靜脈血，運(yùn)用全自動生化分析儀檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferas

8、e, AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltransferase, GGT)。
　　 5. 乙肝病毒檢測
　　 同時抽取每名兒童3ml 靜脈血，采用ELISA 試劑盒檢測血清中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。
　　 二、GSTs基因多態(tài)性與

9、MCs 致肝損傷易感性的病例對照研究
　　 1.病例對照人群篩選
　　 根據(jù)問卷調(diào)查和肝功能酶學(xué)檢測結(jié)果，在MCs 暴露人群中排除乙肝感染、服用肝毒性藥物等其他因素影響后，選擇81名肝功酶異常的人群為病例組，同時隨機(jī)選取92名肝功酶正常的人群作為對照組，進(jìn)行病例對照研究。
　　 2.DNA 提取及基因型檢測
　　 2009年10月抽取每名兒童3ml 靜脈血，采用血液基因組提取試劑盒提取DNA，以β-Glo

10、bin為內(nèi)對照與GSTT1、GSTM1同時擴(kuò)增進(jìn)行多重PCR 檢測。
　　 三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法采用SPSS 14.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，在現(xiàn)況調(diào)查中根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點(diǎn)，分別采用一般頻數(shù)描述、χ 2 檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和多因素方差分析等方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。在病例對照研究中采用χ 2 檢驗(yàn)比較兩組基因型的分布特點(diǎn)，人群特點(diǎn)采用t 檢驗(yàn)和χ 2 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果：

11、
　　 一、兒童MCs內(nèi)外暴露與肝損傷的關(guān)聯(lián)性研究
　　 1．人群流行病學(xué)特征
　　 在招募的1441兒童中，拒絕參加該研究的有24名兒童(1.7％)，未能完成問卷調(diào)查或者抽血檢測的有43名(3.0％)，另外未滿足研究納入標(biāo)準(zhǔn)的有52名(3.6％)，最終有1322名兒童完成了本研究的全部步驟。在三組人群基本情況比較中，年齡(p=0.027)和被動吸煙狀態(tài)(p=0.001)顯示有統(tǒng)計學(xué)差異，而性別比例、乙肝感染、身

12、高體重指數(shù)(body mass index, BMI)、水消費(fèi)量和水產(chǎn)品消費(fèi)頻率等均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p ﹥0.05)。
　　 2．肝損傷多因素回歸分析
　　 問卷調(diào)查內(nèi)容共包括6種危險因素，分別為BMI、HBV 感染、MCs 暴露、肝毒性藥物、劇烈運(yùn)動和被動吸煙。在具有統(tǒng)計學(xué)差異的危險因素中，OR值最大的是HBV感染(OR=7.589，p=0.001)，其次是肝毒性藥物(OR=3.487，p=0.001)和MCs 暴露(

13、OR=1.719，p=0.026)，其他因素如被動吸煙(OR=1.476，p=0.128)、BMI(OR=1.034/1.016，p=0.225)和劇烈運(yùn)動(OR=0.852，p=0.483)在本研究中未發(fā)現(xiàn)與肝損傷存在關(guān)聯(lián)。
　　 3．MC-LR內(nèi)外暴露水平
　　 水中MC-LR濃度：2005～2009年，湖一和湖二水中MC-LR濃度的平均值分別為0.24μg (MC-Lreq)/L和2.58μg (MC-Lreq)/

14、L，而井水中只在2008年檢出，僅為0.1μg(MC-Lreq)/L。其中2008年湖二水中MCs濃度最高，達(dá)到了4.3 μg (MC-Lreq)/L。水產(chǎn)品中MC-LR濃度：魚禽肌肉和肝臟樣本中均檢測出了MC-LR，肝臟中MC-LR濃度均高于肌肉中MC-LR的濃度；對于同類水產(chǎn)品而言，湖二的水產(chǎn)品無論是肌肉中還是肝臟中MC-LR濃度均高于湖一的水產(chǎn)品；湖一和湖二水產(chǎn)品肌肉中MC-LR濃度平均值分別為0.10μg (MC-Lreq)/g

15、和0.22 μg (MC-Lreq)/g。人群血清中MC-LR濃度：高、低暴露組血清中MC-LR濃度范圍分別為0.4～1.9 μg(MC-Lreq)/L和0.1～0.8 μg (MC-Lreq)/L，而對照組未檢出；高暴露組MC-LR 檢出率為91.9％，顯著高于低暴露組84.2％和對照組1.9％；高暴露組MC-LR平均濃度為1.3±0.2μg (MC-Lreq)/L，顯著高于低暴露組0.4±0.1μg (MC-Lreq)/L，而對照組

16、MC-LR平均濃度低于檢測限，未檢出。
　　 4．兒童每日MC-LR 攝入量
　　 根據(jù)問卷調(diào)查和MC-LR 檢測結(jié)果比較，高、低暴露組中每名兒童每日通過飲水途徑MC-LR 攝入量分別為1.55 μg MC-Lreq和0.14 μg MC-Lreq；同時高、低暴露組每名兒童每日通過食用水產(chǎn)品攝入MC-LR 量分別為0.48 μg MC-Lreq和0.22 μgMC-Lreq。因此，高、低暴露組兒童每日MC-LR的攝入量分

17、別為2.03μg MC-Lreq和0.36 μg MC-Lreq，高暴露組兒童每日攝入量已經(jīng)高于WHO 關(guān)于10kg 兒童每天攝入0.4μg MC-Lreq的限值。
　　 5．肝功酶檢測結(jié)果
　　 三組人群肝功酶指標(biāo)ALT、AST、GGT和ALP的平均值均在正常值范圍內(nèi)。高暴露組中AST和ALP 均值分別為33.4±8.1U/L和288.7±92.9 U/L，高于低暴露組的30.3±6.9U/L和285.6±71.8 U

18、/L及對照組的27.6±7.5 U/L和281.3±68.3 U/L，而且均有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.014，p=0.001)，三組間并未發(fā)現(xiàn)ALT和GGT 存在統(tǒng)計學(xué)差異(p ﹥0.05)。
　　 6．乙肝病毒檢測結(jié)果
　　 整個人群HBV 感染率為3.3％，HBsAg 陽性率為3.3％，HBsAb 陽性率為35.7％，HBeAg 陽性率為2.0％，HBeAb 陽性率為1.0％，HBcAb 陽性率為3.3％。高、低暴露組和

19、對照組的乙肝感染率分別為3.7％、2.2％和2.1％，未發(fā)現(xiàn)三組人群的感染率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.387)。
　　 二、GSTs基因多態(tài)性與MCs 肝損傷易感性的病例對照研究
　　 1．病例組和對照組人群可比性
　　 病例組平均年齡為10.9±2.1歲，對照組為11.4±2.0歲，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.13)。病例組中男性47人(58.0％)，每日飲水量1.1±0.3L，BMI為11.2±1.8。對照組中男

20、性58(63.0％)人，每日飲水量1.2±0.2L，BMI為11.5±2.1。兩組人群的性別組成、飲水量和BMI 均無統(tǒng)計學(xué)差異(P ﹥0.05)。
　　 2．基因型檢測結(jié)果
　　 兩組人群GSTM1基因型的分布沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p=1，χ 2 檢驗(yàn))，但病例組中GSTT1(?)的頻率為60.5％，顯著高于對照組的39.1％，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.006)，GSTT1(?)可能是MCs 致肝損傷的易感基因型。病例組

21、中GSTM1(?)/GSTT1(?)頻率為29.6％，高于對照組16.3％，而且GSTM1(?)/GSTT1(?)的個體發(fā)生肝損傷的危險度分別比GSTM1(+)/GSTT1(+)和GSTM1(?)/GSTT1(+)高3.01倍和2.54倍。
　　 結(jié)論：
　　 1．本研究首次檢測了重慶市涪陵區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)兒童MCs內(nèi)外暴露水平，部分兒童每日MCs 攝入量已經(jīng)超出WHO 推薦限值。隨著MCs 暴露劑量的增大，肝功酶水平逐漸升高，需

22、要引起人們的高度重視。
　　 2．同時發(fā)現(xiàn)在MCs 暴露兒童中，GSTT1可能是肝損傷的易感基因型，但未發(fā)現(xiàn)兩組間GSTM1的差異；GSTM1/GSTT1交互作用會增加發(fā)生肝損傷的危險性，導(dǎo)致暴露人群對MCs 致肝損傷的易感性增強(qiáng)。本課題研究結(jié)果顯示重慶市涪陵區(qū)部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)存在MCs 污染，而且已經(jīng)影響兒童肝功能酶學(xué)水平，應(yīng)加強(qiáng)涪陵區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)水環(huán)境中MCs 監(jiān)測和治理，以確保人民飲水健康。同時發(fā)現(xiàn)GSTT1可能是肝損傷的易感基因型，GS

23、TM1(?)/GSTT1(?)交互作用會增加發(fā)生肝損傷的危險性，為保護(hù)易感人群提供了依據(jù)，上述內(nèi)容經(jīng)文獻(xiàn)檢索，國內(nèi)外未見類似的研究報道。同時本課題也存在一些不足，如在問卷調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)部分兒童的父母感染過甲肝，而本研究中未對學(xué)生進(jìn)行甲肝病毒感染的檢測，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析中可能會出現(xiàn)甲肝病毒感染的干擾；在MCs內(nèi)外暴露的檢測中，我們只檢測了主要亞型MC-LR，而未檢測其他亞型如MC-YR和MC-RR等，可能低估了MCs的暴露水平；在多因素回歸分