常見嗜尸性麻蠅分子標(biāo)記的檢測及地區(qū)基因庫的建立.pdf

1、死亡時間(the postmortem interval，PMI)推斷一直是法醫(yī)偵破刑事案件的重點和難點，近年來，利用嗜尸性昆蟲為刑事案件偵破提供線索的案例越來越多，其獨特的優(yōu)越性備受法醫(yī)工作者的關(guān)注。麻蠅科很多種類的麻蠅都有應(yīng)用于PMI推斷的潛在價值。嗜尸性麻蠅準(zhǔn)確、快速的種類鑒定是利用其進(jìn)行PMI推斷的關(guān)鍵步驟，然而至今許多嗜尸性麻蠅的幼蟲仍沒有系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定要點，甚至一些雌性成蟲（麻蠅屬）仍然難以區(qū)分。因而，麻蠅在法醫(yī)學(xué)實踐中的

2、應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。簡便、快捷、有效的麻蠅種類鑒定方法是法醫(yī)昆蟲學(xué)亟待解決的一個難題。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為嗜尸性麻蠅種類鑒定帶來了曙光，大量研究證實線粒體DNA(mtDNA)分子標(biāo)記可以用來進(jìn)行嗜尸性麻蠅的種類鑒定。分子鑒定得以推廣的前提條件是大量基因數(shù)據(jù)的存在。中國地域廣闊，氣候和地理環(huán)境復(fù)雜多變，麻蠅種類十分豐富，但尚無嗜尸性麻蠅的基因數(shù)據(jù)，這對法醫(yī)昆蟲學(xué)在國內(nèi)的發(fā)展不利，也使全球嗜尸性麻蠅分子特性對比研究受到嚴(yán)重制約。因此

3、，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究不同基因片段對嗜尸性麻蠅的鑒定效力，尋找嗜尸性麻蠅的分子標(biāo)記，建立我國嗜尸性麻蠅基因庫十分必要。
　　 目的:
　　 1.收集嗜尸性麻蠅樣本，對我國嗜尸性麻蠅常見種類、分布及嗜尸特性進(jìn)行初步調(diào)查;
　　 2.改良、優(yōu)化嗜尸性麻蠅DNA提取方法，研究不同基因片段對嗜尸性麻蠅的鑒定效力，嘗試聯(lián)合分析等分子鑒定方法，篩選出易于推廣的嗜尸性麻蠅分子標(biāo)記，初步建立我國嗜尸性麻蠅的基因庫;
　　

4、 3.嘗試在實際案例中應(yīng)用嗜尸性麻蠅對PMI進(jìn)行推斷，把分子鑒定運用到實踐工作中。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)不同地理緯度為劃分依據(jù)，在全國范圍內(nèi)選取代表性區(qū)域，每年定期應(yīng)用兔子、狗、豬等動物尸體誘捕各類嗜尸性麻蠅。按照形態(tài)學(xué)特征對樣本進(jìn)行初步分類、統(tǒng)計及編號。
　　 2.改良目前常用DNA提取方法，實現(xiàn)用少量組織獲取足量的高品質(zhì)DNA。探索目前國際上常用的引物序列，并根據(jù)蠅類mtDNA的COⅠ、COⅡ、16

5、SrDNA、ND1、Cytb等序列運用primer5軟件設(shè)計引物序列。使用PCR試劑盒進(jìn)行擴增，常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA及PCR產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化，純化產(chǎn)物批量測序。序列檢測結(jié)果用Chromas v1.43、ClustalW等軟件顯示并截取等長度片段，再運用Mega v4.0軟件進(jìn)行聚類分析，根據(jù)結(jié)果篩選分子標(biāo)記。將采集于我國不同地理、氣候條件代表性地域的嗜尸性麻蠅基因數(shù)據(jù)上傳GenBank，構(gòu)建完善我國嗜尸性麻蠅基因

6、庫。
　　 3.在實際案例中，應(yīng)用前期篩選出的分子標(biāo)記鑒定嗜尸性麻蠅，根據(jù)已有發(fā)育資料嘗試PMI的推斷，探索嗜尸性麻蠅作為法庭證據(jù)的程序和方法。
　　 結(jié)果:
　　 1.2009-2011年對我國18省29個地區(qū)進(jìn)行了麻蠅誘捕，共捕獲包括棕尾別麻蠅（Boerttcherisca peregrine）、黑尾黑麻蠅(Helicophagella melanura)、白頭亞麻蠅(Parasarcophagaalbice

7、ps)、醬亞麻蠅（Parasarcophaga dux）、華南球麻蠅（Phallosphaera gravel）等麻蠅樣本，進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定后篩選出272個樣本，進(jìn)行編號。
　　 2.改良后的SDS-PK法抽提效力較高，從麻蠅胸肌、頭部、腿部、翅膀均可成功提取DNA。應(yīng)用272-bp和278-bp的COⅠ片段、289bp和555-bp的16Sr RNA片段、189-bp和637-bp的COⅡ片段用來區(qū)別常見嗜尸性麻蠅時，種間分

8、化岐數(shù)一般都大于5％，個別種間甚至超過10％，但對于同一屬不同種的種間分化岐數(shù)有時小5％;種內(nèi)分化岐數(shù)一般都小于3％，很多個體種內(nèi)差異為0。 ND1及Cytb序列應(yīng)用于麻蠅種類鑒定時效果較差。使用短片聯(lián)合分析時，種間進(jìn)化岐數(shù)和種內(nèi)進(jìn)化岐數(shù)明顯更為合理，準(zhǔn)確性較高。
　　 3.實踐中應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行種類鑒定是可行的，應(yīng)用嗜尸性麻蠅對案件進(jìn)行PMI推斷的準(zhǔn)確性要高于傳統(tǒng)方法，但受較多因素影響，穩(wěn)定性稍差。
　　 結(jié)論:

9、>　　 1.通過大量動物演替實驗，在我國部分地區(qū)進(jìn)行嗜尸性麻蠅樣本的采集，補充了嗜尸性麻蠅種類和分布資料。
　　 2.經(jīng)過改良后的DNA提取方法，應(yīng)用較少的組織（如單附足）既可獲得足夠量的DNA。短片段的(200-600bp)16SrRNA、COⅠ、COⅡ分子標(biāo)記具有簡便、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點，多片段聯(lián)合運用可確保種類鑒定的準(zhǔn)確性。
　　 3.GenBank中大量具有地域性代表性基因序列的上傳，初步完成了我國嗜尸性麻蠅基因