豬流產(chǎn)嗜性衣原體單抗制備及阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、流產(chǎn)嗜性衣原體（Chlamydophila abortus，Cabortus）是引起豬、牛、羊等家畜流產(chǎn)、死胎等繁殖系統(tǒng)疾病的重要病原體，每年給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，作為一種重要的人畜共患病原體，也給人類的公共衛(wèi)生安全帶來(lái)嚴(yán)重的危害。近幾年來(lái)的豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)豬場(chǎng)中衣原體流行相當(dāng)普遍。目前，豬場(chǎng)中都沒(méi)有使用衣原體疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，因此檢測(cè)血清中抗體可以作為該病臨床診斷的重要依據(jù)。因此，本研究利用重組MOMP蛋

2、白和單克隆抗體建立一種快速、簡(jiǎn)便的阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法，為臨床檢測(cè)提供技術(shù)支持。
　　 1.豬流產(chǎn)嗜性衣原體MOMP克隆表達(dá)
　　 以豬流產(chǎn)嗜性衣原體HB1043株的全基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到全長(zhǎng)的MOMP基因，連接T載體并測(cè)序。對(duì)基因序列進(jìn)行分析后，選擇271-1176bp進(jìn)行克隆表達(dá)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-MOMP，轉(zhuǎn)化BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并采用鎳離子親合層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)

3、物純化，得到34kDa的重組蛋白，經(jīng)Western-Blot檢測(cè)證實(shí)重組蛋白具有免疫學(xué)活性。
　　 2.MOMP單克隆抗體制各
　　 使用甲醛滅活的衣原體雞胚卵黃囊液離心后的上清與弗氏佐劑混合作為免疫原，免疫6周齡BALB/c小鼠。經(jīng)三次免疫后，使用重組MOMP蛋白間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)。當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到1∶3200時(shí)進(jìn)行融合，使用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆。最后篩選出5株特異性強(qiáng)、可以穩(wěn)定傳代的雜交瘤細(xì)胞株:

4、5D7、1D3、4E5、1E6、4C9。進(jìn)一步鑒定結(jié)果表明，5D7和1E6的亞型分別為IgG1和IgG3，其余三株亞型均為IgG2b;腹水效價(jià)為105-106。采用辛酸硫酸銨法對(duì)效價(jià)較高的兩株單克隆抗體的腹水進(jìn)行純化，最后用HRP進(jìn)行標(biāo)記。
　　 3.阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立
　　 以重組MOMP作為抗原包被ELISA板，以酶標(biāo)4C9株單抗作為酶標(biāo)物建立阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后選擇的反應(yīng)條件為:蛋