嗜尸性麗蠅分子標(biāo)記的檢測及發(fā)育規(guī)律的研究.pdf

1、背景：
　　法醫(yī)昆蟲學(xué)在實(shí)踐中主要應(yīng)用于死亡時間(postmortem inteval，PMI)推斷。法醫(yī)昆蟲學(xué)推斷PMI的原理主要有兩種:一是研究尸體上主要嗜尸性昆蟲的生長發(fā)育規(guī)律來推斷PMI;二是研究尸體上昆蟲的種類及演替規(guī)律來推斷PMI。即依據(jù)蠅類的生活史、群落組成隨季節(jié)和時間的變動規(guī)律來推斷PMI。中國幅員遼闊，不同地域昆蟲的種類及生活習(xí)性均不相同，不能簡單地照搬其它地方的研究資料來進(jìn)行法醫(yī)實(shí)踐，但有必要借鑒前人的研究方法

2、來對各地區(qū)嗜尸性昆蟲群落演替展開調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢物種，并加以飼養(yǎng)，進(jìn)一步研究其生長發(fā)育規(guī)律，逐步建立適合于當(dāng)?shù)氐氖仁岳ハx種類的數(shù)據(jù)庫和推測系統(tǒng)，為法醫(yī)實(shí)踐提供依據(jù)。對嗜尸性昆蟲，尤其是嗜尸性麗蠅進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的種類鑒定，是PMI推斷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有著特別重要的作用。麗蠅往往是第一批到達(dá)尸體并產(chǎn)卵的嗜尸性昆蟲，具有重要的法醫(yī)學(xué)意義，但一些近緣麗蠅物種和麗蠅幼蟲之間的鑒別尚缺乏明顯的形態(tài)學(xué)特征。分子生物學(xué)物種鑒定技術(shù)，是形態(tài)學(xué)鑒定的

3、有力補(bǔ)充，此類方法快捷、簡便、有效。中國地理環(huán)境多樣，麗蠅種類繁多，還需要積累更多的基因資源來進(jìn)行鑒定研究。因此有必要在全國范圍收集大量麗蠅樣本，并開發(fā)新的嗜尸性麗蠅的分子標(biāo)記，完善嗜尸性麗蠅的鑒定系統(tǒng)。同時完善各種嗜尸性蠅類的發(fā)育歷期、生長曲線、及嗜尸性昆蟲的演替等資料。但目前，國內(nèi)這些方面的資料還很缺乏。
　　目的：
　　1.在全國多個地區(qū)收集麗蠅樣本，對我國常見嗜尸性麗蠅的種類、分布及嗜尸特性展開調(diào)查，并在長沙地區(qū)夏季

4、豬尸體上對常見嗜尸性昆蟲群落種類和演替規(guī)律進(jìn)行調(diào)查研究。
　　2.利用278bp COI線粒體基因片段和272bp COI片段對來自全國28個地區(qū)的130個麗蠅樣本進(jìn)行種類鑒定，檢測這兩個基因片段對不同麗蠅物種的鑒別效力，構(gòu)建并完善我國嗜尸性麗蠅的分子標(biāo)記系統(tǒng)。
　　3.飼養(yǎng)優(yōu)勢嗜尸性蠅種，并研究其生長發(fā)育規(guī)律，為本地區(qū)法醫(yī)昆蟲學(xué)實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.在全國不同經(jīng)緯度的28個地區(qū)，

5、用動物尸體誘捕麗蠅并收集樣本。夏季在長沙地區(qū)連續(xù)三年用豬尸體進(jìn)行演替實(shí)驗(yàn)。
　　2.用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，用勻漿法、蛋白酶K+酚/氯仿/異戊醇法提取足夠的基因組DNA，用Promega試劑盒擴(kuò)增PCR，用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA和PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化，產(chǎn)物批量送測序。測序結(jié)果用Chromas及ClustalW等軟件閱讀、比對，截取等長度片段。用Mega4.0進(jìn)行序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。將所獲得嗜尸

6、性麗蠅基因片段的數(shù)據(jù)上傳GenBank數(shù)據(jù)庫。
　　3.夏季在室內(nèi)自然條件下飼養(yǎng)絲光綠蠅、大頭金蠅和棕尾別麻蠅，測量它們的幼蟲的體長和體重，還測量蠅蛹的長、寬、重，并繪制它們隨時間變化的生長曲線圖、構(gòu)建相關(guān)方程。
　　結(jié)果：
　　1.三年以來在全國范圍17個省28個地區(qū)收集了大量麗蠅樣本，初步形態(tài)學(xué)鑒定并選出13種130個麗蠅樣本。
　　2.連續(xù)三年夏季在長沙地區(qū)野外及室內(nèi)用豬尸體進(jìn)行演替實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)嗜尸性昆蟲29

7、種，分屬3目15科。
　　3.用278bp COI和272bp COI基因片段對來自全國多個地區(qū)的麗蠅進(jìn)行物種鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩個片段均適合于嗜尸性麗蠅的物種鑒定，尤其是一些近緣種類的鑒別。
　　4.用278bp COI片段進(jìn)行鑒定時，發(fā)現(xiàn)絲光綠蠅Lucilia sericata(Meigen，1826)和叉葉綠蠅Lucilia caesar(Linnaeus，1758)存在種內(nèi)基因地域差異。而272bp COI片段進(jìn)行鑒定時，

8、發(fā)現(xiàn)大頭金蠅Chrysomyamegacephala(Fabricius，1794)和新陸原伏蠅Protophormia terraenovae(Robineau-Desvoidy，1830)存在種內(nèi)基因地域差異。
　　5.成功地飼養(yǎng)了絲光綠蠅L.sericata、大頭金蠅C.megacephala和棕尾別麻蠅Boerttcherisca peregrine(Robineau-Desvordy，1830)。繪制了幼蟲體長、體重，蠅

9、蛹長、寬、重隨時間變化的生長曲線圖。發(fā)現(xiàn)幼蟲體長和時間的關(guān)系吻合三次方程L=aT3+bT2+cT+d，蠅蛹體重則符合一次方程W=aT+b。相關(guān)性顯著(R2＞0.9，P＜0.05)其中，L代表蛆長，W代表蛹重，T代表時間，a、b、c、d為常數(shù)。
　　結(jié)論：
　　1.在我國多個地區(qū)進(jìn)行嗜尸性麗蠅樣本的采集，補(bǔ)充了嗜尸性麗蠅種類及分布資料。
　　2.三年來在長沙地區(qū)進(jìn)行了嗜尸性昆蟲演替實(shí)驗(yàn)，對推斷PMI等法醫(yī)實(shí)踐具有一定的實(shí)

10、用價(jià)值。
　　3.短片段COI（278bp COI和272bp COI基因片段），具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、有效鑒別物種等優(yōu)點(diǎn)，適合基層法醫(yī)工作者應(yīng)用。
　　4.向GenBank數(shù)據(jù)庫上傳了13種麗蠅物種的145條COI基因片段，完善了數(shù)據(jù)庫并初步構(gòu)建了我國嗜尸性麗蠅分子標(biāo)記系統(tǒng)。
　　5.飼養(yǎng)一些有法醫(yī)學(xué)重要意義的嗜尸性蒼蠅并進(jìn)行生長發(fā)育規(guī)律研究，獲得了一些基礎(chǔ)性科學(xué)數(shù)據(jù)，為法醫(yī)實(shí)踐工作提供了理論依據(jù)，也為今后研究多種嗜