孤核受體NR4A1在環(huán)孢素A影響移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:環(huán)孢素A對(duì)移植免疫耐受誘導(dǎo)的負(fù)向作用的研究
　　目的：建立小鼠腹部異位心臟移植模型，探討環(huán)孢素A對(duì)移植免疫耐受誘導(dǎo)的不同作用。
　　方法：1：建立Balb/c→C57BL/6的小鼠心臟移植物急性排斥反應(yīng)模型，實(shí)驗(yàn)組給予環(huán)孢素A（10mg/kg·qd）皮下注射，觀察各組心臟移植物的生存時(shí)間；2：在移植術(shù)后7天，觀察心臟移植物病理變化；3：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植術(shù)后7天各組脾臟T淋巴細(xì)胞T

2、h1/Th2及Treg細(xì)胞亞群比例及活化誘導(dǎo)凋亡比例；4：PCR及western blot檢測(cè)環(huán)孢素A對(duì)移植物局部NR4A1表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：1：CsA延長(zhǎng)心臟移植物生存期，但CsA抑制Th1細(xì)胞亞群比例的同時(shí)也抑制Treg亞群比例及T細(xì)胞活化誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)CsA導(dǎo)致小鼠腎功能損傷；2：移植術(shù)后心臟移植物局部NR4A1表達(dá)明顯升高，CsA降低NR4A1蛋白量。
　　結(jié)論：CsA對(duì)移植免疫耐受可能存在不同的作用，其對(duì)

3、Treg及AICD的抑制不利于免疫耐受的誘導(dǎo)，且CsA導(dǎo)致小鼠腎功能損傷，其負(fù)向作用可能與NR4A1蛋白降低有關(guān)。
　　第二部分:激活NR4A1拮抗環(huán)孢素A對(duì)免疫耐受誘導(dǎo)的負(fù)向作用
　　目的：探討NR4A1在環(huán)孢素A抑制Treg、AICD及環(huán)孢素A誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化中的作用，明確Csn-B拮抗環(huán)孢素A免疫耐受誘導(dǎo)負(fù)向作用的機(jī)制。
　　方法：1：磁珠分選CD4T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)CsA及Csn-B對(duì)T細(xì)胞亞群分化及活化誘導(dǎo)凋

4、亡的影響；2：體外培養(yǎng)小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，檢測(cè)Csn-B對(duì)CsA誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響；3：建立小鼠心臟移植及皮膚移植模型，單獨(dú)給予CsA（10mg/kg·qd）或聯(lián)合給予Csn-B（13mg/kg·qod）及CsA（10mg/kg·qd），觀察各組移植物的生存時(shí)間，流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟T細(xì)胞亞群比例及活化誘導(dǎo)凋亡比例。4：以低鈉飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠，給予CsA(30mg/kg·d)皮下注射，構(gòu)建小鼠腎纖維化模型，Csn-B

5、治療組給予13mg/kg·qod腹腔注射，觀察Csn-B對(duì)CsA誘導(dǎo)的腎功能損傷及間質(zhì)纖維化的影響，PCR檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路致纖維化靶基因表達(dá)。
　　結(jié)果：1：Csn-B增強(qiáng)了CsA對(duì)Th1細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)Csn-B能拮抗CsA抑制Treg亞群分化及T細(xì)胞活化誘導(dǎo)凋亡的作用；2：Csn-B聯(lián)合CsA能明顯延長(zhǎng)皮膚及心臟移植物生存期，移植物局部炎性浸潤(rùn)明顯減輕；3：Csn-B抑制CsA誘導(dǎo)的小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化；4：

6、Csn-B減輕CsA導(dǎo)致的腎功能損傷及腎間質(zhì)纖維化。結(jié)論：Csn-B拮抗環(huán)孢素A對(duì)Treg及AICD的抑制并減輕環(huán)孢素A導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化等免疫耐受誘導(dǎo)的負(fù)向作用，同時(shí)強(qiáng)化對(duì)Th1細(xì)胞的抑制作用，顯著延長(zhǎng)移植物生存期。
　　第三部分:CsA調(diào)控NR4A1表達(dá)及NR4A1調(diào)控TGF-β信號(hào)通路靶基因的機(jī)制研究
　　目的：探討CsA調(diào)控NR4A1的分子機(jī)制及NR4A1調(diào)控TGF-β信號(hào)通路靶基因的分子機(jī)制。
　　方法：1：

7、體外培養(yǎng)小鼠原代T細(xì)胞及EL4細(xì)胞，檢測(cè)CsA對(duì)NR4A1表達(dá)的調(diào)控作用；2：使用免疫共沉淀證實(shí)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的VHL與NR4A1蛋白的相互作用；3：使用小干擾RNA敲低VHL表達(dá)，驗(yàn)證其在CsA調(diào)控NR4A1中的作用；4：ELISA檢測(cè)CsA及Csn-B對(duì)小鼠腎臟成纖維細(xì)胞TGF-β表達(dá)水平的影響；5：PCR及Western blot檢測(cè)CsA及Csn-B對(duì)小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路靶基因的作用。
　　結(jié)果：1：