血管活性腸肽在大鼠移植肝缺血再灌注損傷及誘導(dǎo)免疫耐受中的作用.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分、血管活性腸肽對枯否細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)的作用
　　 目的：研究血管活性腸肽(VIP)對枯否細(xì)胞(KCs)的活性及其表面Toll樣受體4表達(dá)的影響并闡明機(jī)制。
　　 方法：采用膠原酶原位灌注法分離及提純枯否細(xì)胞。將細(xì)胞分為3組：A組為對照組(Controlgroup)，培養(yǎng)正常大鼠KCs；B組為脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激組(LPSgroup)，

2、在開始培養(yǎng)KCs時(shí)，培養(yǎng)液中加入終濃度為10mg/1LPS；C組為LPS＋VIP組(VIPgroup)，培養(yǎng)液中先加入1×10－8molVIP培養(yǎng)24h，然后再加入10mg/lLPS。各組分別于培養(yǎng)6h后獲取標(biāo)本作相應(yīng)指標(biāo)檢測，重復(fù)8次實(shí)驗(yàn)后取均值(n＝8)。將各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化，碳粒吞噬實(shí)驗(yàn)檢測各組枯否細(xì)胞吞噬活性，抗單核巨噬細(xì)胞胞質(zhì)抗原(ED-2)免疫組化染色檢測純度，反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測枯否

3、細(xì)胞TLR4及核因子κB(NucleartranscriptionfactorkappaB,NF-κB)mRNA表達(dá)情況，蛋白質(zhì)印跡分析(Westernblot)檢測TLR4及NF-κB蛋白水平，電泳遷移率分析(EMSA)檢測NF-κBDNA結(jié)合活性，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞上清液中IL-1和TNF-α水平。
　　 結(jié)果：新分離的KCs在倒置顯微鏡下呈球形，懸浮于培養(yǎng)基中；約6h后，大部分細(xì)胞貼壁呈扁圓形，少數(shù)細(xì)胞

4、伸出偽足；24h后大部分細(xì)胞伸出偽足，約48h后所有細(xì)胞已完全展開，呈典型星形和多角形，細(xì)胞體積明顯變大；細(xì)胞爬片后蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色，KCs呈典型星狀，胞核呈腎形；各組枯否細(xì)胞分離純度約為90％，活性約為96％。吞噬能力檢測與B組比較，C組細(xì)胞內(nèi)的碳粒密度明顯低于前者，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變；與A組比較，B組TLR4、NF-κB在mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，與B組比較，C組

5、上述指標(biāo)水平顯著降低(P＜0.05)；與A組比較，B組NF-κBDNA結(jié)合活性顯著增高(P＜0.05)，與B組比較，C組NF-κBDNA結(jié)合活性顯著降低(P＜0.05)；與A組比較，B組IL-1和TNF-α水平明顯增高(P＜0.05)，與B組比較，C組IL-1和TNF-α水平明顯較低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)采用膠原酶原位灌注法分離及提純的肝臟枯否細(xì)胞純度可達(dá)90％，活性約為96％；
　　 (

6、2)VIP能抑制枯否細(xì)胞吞噬活性，從而減少枯否細(xì)胞激活后釋放TNF-α及IL-1；
　　 (3)VIP能抑制枯否細(xì)胞TLR4的表達(dá)及NF-κB的激活；
　　 第二部分、大鼠原位肝移植模型的建立
　　 目的：建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型。
　　 方法：采用改良Kamada’s“兩袖套法”建立大鼠肝移植模型。模型的建立均采用封閉群雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，受體略大于供體。術(shù)后飼喂10％葡萄

7、糖水，前3d肌注10萬U青霉素，術(shù)后均不使用免疫抑制劑。
　　 結(jié)果：建模初期共完成30例，僅有2例完成了手術(shù)全過程，其余28例均在手術(shù)過程中死亡，死亡原因?yàn)榇蟪鲅?例，麻醉意外8例，氣胸5例，血管意外損傷4例，原因不明2例。成功2例分別于術(shù)后第0.5h，2h后死于肝上下腔靜脈(Suprahepaticinferiorvenacave,SIVC)吻合口出血；建模成熟穩(wěn)定期共完成100例定型手術(shù)，供肝獲取時(shí)間為45-60min，熱

8、缺血時(shí)間0-0.5min，供肝修整時(shí)間為12-15min，供體冷保存時(shí)間為2h，受體手術(shù)時(shí)間為85-100min，其中無肝期18-22min。24h存活率為92.0％(92/100)，1w存活率為83.0(83/100)。手術(shù)失敗或24h內(nèi)死亡8例：麻醉意外3例，術(shù)中大失血4例，膈肌破裂導(dǎo)致氣胸1例；1d-7d內(nèi)死亡9例：感染4例，膽漏3例，原因不明2例。
　　 結(jié)論：
　　 (1)采用改良Kamada’s“二袖套法”建

9、立大鼠原位肝移植模型穩(wěn)定可靠，可為后繼實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。
　　 (2)大鼠原位肝移植手術(shù)難度大，盡量縮短手術(shù)時(shí)間和無肝期以及精細(xì)的吻合技術(shù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵。
　　 第三部分、血管活性腸肽對大鼠移植肝臟缺血再灌注損傷的作用
　　 目的：研究血管活性腸肽在大鼠移植肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：供、受體均采用雄性SD，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，n＝8：A組為假手術(shù)組，開腹后游離肝周韌帶，解

10、剖肝門后關(guān)腹；B組為VIP組，供體術(shù)前3d隔日經(jīng)腹腔注射VIP2nmol；C組為對照組，供體術(shù)前隔日經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。采用改良Kamada’s“兩袖套法”建立大鼠肝移植模型，24h后處死大鼠檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alaninetransaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartatetransaminase,AST)水平，RT-PCR檢測TLR4及NF-κBmRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測TLR4及NF-κB蛋白

11、含量，EMSA法檢測NF-κBDNA結(jié)合活性，ELISA法檢測血清IL-1和TNF-α水平，dUTP原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TerminaldeoxynecleotidytransferasemediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)法檢測肝組織凋亡情況，并計(jì)算凋亡指數(shù)，肝組織HE染色后置光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化，并根據(jù)Suzuki’s評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量評分。
　　 結(jié)果：B、C兩組供體獲取時(shí)間，熱缺血時(shí)

12、間，無肝期及受體手術(shù)時(shí)間比較無顯著性差異(P＞0.05)；與C組比較，B組血清ALT、AST水平明顯降低(P＜0.05)；與C組比較，B組TLR4及NF-κB在mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)；與C組比較，B組NF-κBDNA結(jié)合活性明顯降低(P＜0.05)；與C組比較，B組血清IL-1、TNF-α及AI明顯降低(P＜0.05)；與C組比較，B組淤血、空泡變性及壞死Suzuki’s評分均較低(P＜0.05)。
　　

13、 結(jié)論：
　　 (1)VIP能下調(diào)大鼠移植肝臟內(nèi)枯否細(xì)胞TLR4的表達(dá)；
　　 (2)VIP能降低大鼠移植肝臟內(nèi)NF-κB的活性；
　　 (3)VIP能減少細(xì)胞因子釋放，對肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用；
　　 (4)VIP對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制是通過抑制TLR4表達(dá)及NF-κB活化實(shí)現(xiàn)的。
　　 第四部分、血管活性腸肽誘導(dǎo)大鼠肝臟免疫耐受的研究
　　 目的：探討血管活性腸肽在誘

14、導(dǎo)大鼠肝臟免疫耐受中的作用并闡明其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性SD大鼠及Wistar大鼠，清潔級。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，n＝16，其中8只用以取標(biāo)本檢測，其余8只觀察生存期（死亡當(dāng)天為生存期，超過5w則視為長期存活）：A組為同基因組，SD→SD，術(shù)前3d供體隔日經(jīng)腹腔注射VIP2nmol，術(shù)后受體隔日腹腔注射VIP2nmol3次(d1，d3，d5)；B組為排斥組，SD→Wistar，不做任何預(yù)處理；C組為VIP組，SD

15、-→Wistar，術(shù)前3d供體隔日經(jīng)腹腔注射VIP2nmol，術(shù)后受體隔日腹腔注射VIP2nmol3次(d1,d3,d5)；D組為對照組，SD→Wistar，術(shù)前3d供體隔日經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水，術(shù)后受體隔日腹腔注射等量生理鹽水3次(d1,d3,d5)。采用第二部分所述改良Kamada’s“兩袖套法”建立肝移植模型。移植后7d將各組動(dòng)物處死8只（其余繼續(xù)喂養(yǎng)觀察生存期），檢測血清ALT、AST及總膽紅素(Totalbilirubin,

16、TBIL)，RT-PCR檢測IL-2，IL-4，IL-10、干擾素(Interferon，IFN)-γ、TLR4mRNA表達(dá)，Westernblot檢測各組TLR4蛋白表達(dá)水平，ELISA法檢測各組血清IL-2，IL-4，IL-10及IFN-γ濃度，TUNEL法檢測肝組織凋亡情況，并計(jì)算凋亡指數(shù)，各組肝組織HE染色后置光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化，并根據(jù)Banff’s系統(tǒng)分級評分方案對各組排斥反應(yīng)程度進(jìn)行半定量評估。
　　 結(jié)果：與

17、D組比較，C組大鼠生存期較長(P＜0.05)；與D組比較，C組大鼠血清ALT、AST及TBIL水平較低(P＜0.05)；與A組比較，B、D兩組大鼠TLR4mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，C組表達(dá)水平與之無顯著性差異(P＞0.05)；IL-2及IFN-γmRNA在A組未檢測到表達(dá)；與D組比較，C組IL-2及IFN-γmRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)；與A組比較，B、D組大鼠IL-4及IL-10mRNA表達(dá)水平較低(P

18、＜0.05)，C組表達(dá)水平與之無顯著性差異(P＞0.05)；與D組比較，C組血清IL-2及IFN-γ濃度較低(P＜0.05)；與A組比較，B、D組大鼠血清IL-4及IL-10濃度水平較低，C組與之無顯著性差異(P＞0.05)；與D組比較，C組AI及RAI均較低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)VIP通過上調(diào)Th2型細(xì)胞因子水平誘導(dǎo)移植物的免疫耐受，對大鼠移植肝臟術(shù)后急性排斥反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)作用；
　　 (