高糖環(huán)境下NCoR siRNA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有分化成不同細(xì)胞組織的能力，其中包括成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞以及肌細(xì)胞。體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在合適的環(huán)境和條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體外進(jìn)行34-42次的分裂增殖，增殖過(guò)程中始終保持梭形并呈漩渦狀排列。不僅如此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在冷凍保存進(jìn)行復(fù)蘇后，仍然具備干細(xì)胞的特性。BMSCs不僅存在于骨髓中，還游離于骨組織外。當(dāng)其在適當(dāng)信號(hào)刺激時(shí)，可游離出骨組織，到達(dá)效應(yīng)靶器

2、官組織中，這種生物學(xué)行為叫“歸巢”。在適當(dāng)?shù)纳锖臀锢硪蛩嘏c足夠的特異性信號(hào)傳導(dǎo)的存在，BMSCs能夠分化成所需的特定細(xì)胞組織。由于這些性質(zhì)，BMSC已經(jīng)成為肌肉骨骼組織再生治療研究的主要細(xì)胞來(lái)源。
　　BMSCs分化成骨細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)和轉(zhuǎn)錄水平的級(jí)聯(lián)放大調(diào)控，這需要大量基因表達(dá)之間的精細(xì)時(shí)空調(diào)節(jié)。研究表明，原發(fā)性成骨分化誘導(dǎo)主要由Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。Runx2激活和調(diào)節(jié)成骨作為許多信號(hào)通路的靶

3、基因，包括但不限于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-b1)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，Wingless type1(Wnt)，Hedgehog(HH)和(Nel)樣蛋白1型(NELL-1)。誘導(dǎo)后，成骨細(xì)胞分化下游的前成骨細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞成熟和基質(zhì)礦化的過(guò)程受其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，包括Osterix，BSP，OCN和OPN。這個(gè)過(guò)程也受到許多其他物理和生物因素的影響，其中大多數(shù)已經(jīng)在體外證明，并且仍然在仔細(xì)審查。
　　影響B(tài)MSC

4、s的增殖和成骨分化的物理因素，如高葡萄糖，已經(jīng)很好地建立并通過(guò)幾個(gè)體外研究證明。臨床證據(jù)表明，與正常人相比，糖尿病患者的骨折不愈合和延遲愈合更高，此外糖尿病患者早期骨質(zhì)疏松的發(fā)生率高。最近的體外研究已經(jīng)證明高葡萄糖微環(huán)境降低細(xì)胞BMP的表達(dá)，細(xì)胞BMP是成骨分化的終末期期間的重要調(diào)節(jié)蛋白，因此抑制該過(guò)程。進(jìn)一步了解高葡萄糖對(duì)骨代謝的負(fù)面影響并設(shè)計(jì)減輕這種合并癥的方法的研究正在進(jìn)行。
　　核受體輔助抑制因子(nuclear rece

5、ptor corepressor，NCoR)屬于核受體輔助抑制因子，通過(guò)與許多其它轉(zhuǎn)錄因子（包括NF-Eb，AKT和PPARα）相互作用而發(fā)揮各種抑制功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)NCoR可以與HDAC結(jié)合成復(fù)合物，通過(guò)影響蛋白的轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體代謝、炎癥以及腫瘤發(fā)生中扮演著重要角色。JinZ報(bào)道HDAC9與視黃酸和甲狀腺激素受體(SMRT)/NCoR共抑制因子的沉默介體協(xié)同抑制PPARγ活性，并將HDAC9鑒定為骨重建和骨骼穩(wěn)態(tài)的重要和生理學(xué)相關(guān)的調(diào)節(jié)

6、劑。最近，Yi Qin證明NCoR在標(biāo)準(zhǔn)成骨培養(yǎng)基中通過(guò)P13K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。因此，在高葡萄糖微環(huán)境下，NCoR基因敲除對(duì)BMSCs的成骨分化的作用是什么？
　　研究目的:觀察NCoRsiRNA對(duì)BMSCs在高葡萄糖微環(huán)境下增殖和成骨分化的影響。
　　研究方法:1、根據(jù)NCoRsiRNA靶位點(diǎn)的選擇原則，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中擇優(yōu)選取三條siRNA序列，通過(guò)構(gòu)建干擾及過(guò)表達(dá)載體，篩選出

7、最佳序列。2、檢測(cè)NCoR對(duì)BMSCs在高葡萄糖微環(huán)境下增殖的影響。在96孔板上按1×106/孔接種大鼠BMSCs，設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（無(wú)目標(biāo)siRNA和NCoRsiRNA組，每組設(shè)3復(fù)孔。從轉(zhuǎn)染后第1天開(kāi)始，達(dá)到65％的匯合后，將細(xì)胞樣品在含有5.5，16.5，25和35mmol/L葡萄糖濃度的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)9天后，使用甲基噻唑基四唑(MTT)測(cè)定細(xì)胞增殖，并在490nm測(cè)定吸光度。3、觀察NCoR對(duì)大鼠BMSCs誘導(dǎo)

8、成骨分化的影響。在含有25mmol/L（高葡萄糖）和5.5mmol/L葡萄糖（對(duì)照）的成骨培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)用NCoRsiRNA或無(wú)目標(biāo)siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞21天，然后通過(guò)測(cè)量細(xì)胞ALP活性，鈣沉積RT-PCR檢測(cè)相關(guān)成骨基因;Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的表達(dá)，來(lái)測(cè)定成骨分化。
　　結(jié)果:1、成功構(gòu)建了NCoRsiRNA及無(wú)目標(biāo)siRNA質(zhì)粒載體，并篩選了最佳干擾序列，載體由廣州Cyagen生物科技公司合成。2

9、、NCoRsiRNA可使BMSCs的增殖降低。用NCoRsiRNA或無(wú)目標(biāo)siRNA轉(zhuǎn)染的BMSCs在含有四個(gè)不同葡萄糖濃度（5.5，16.5，25和35mmol/L）的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。與對(duì)照組相比，第1d三組細(xì)胞增殖差異不大。從第3d開(kāi)始，在所用葡萄糖濃度，NCoRsiRNA組細(xì)胞數(shù)量及增殖明顯低于對(duì)照組。提示NCoR可促進(jìn)BMSCs增殖。3、NCoRsiRNA可在高葡萄糖下促進(jìn)BMSCs的成骨分化。與對(duì)照組相比，通過(guò)ALP-ELI

10、SA試劑盒和鈣診斷試劑盒測(cè)定的， NCoRsiRNA組細(xì)胞的ALP活性以及礦化（鈣沉淀）在25mmol/L（高葡萄糖）和5.5mmol/L葡萄糖下都明顯增加。此外，實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)成骨分化相關(guān)的五個(gè)基因Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，NCoRsiRNA組Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP表達(dá)都顯著增加(P＜0.01)。提示NCoR負(fù)性調(diào)控大鼠BMSCs的成骨分化。
　　結(jié)論

11、:我們利用RNA干擾技術(shù)成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了NCoR基因特異性的小干擾siRNA，以及設(shè)計(jì)并構(gòu)建了無(wú)目標(biāo)siRNA。經(jīng)證實(shí)，基因沉默的效果良好。我們成功將NCoR siRNA和無(wú)目標(biāo)siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，并證實(shí)轉(zhuǎn)染效率較高，然后在四個(gè)不同葡萄糖濃度下（5.5，16.5，25和35mmol/L）的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后檢測(cè)BMSCs的增殖發(fā)現(xiàn)，NCoR siRNA組BMSCs的增殖明顯下降，提示NCoR可促進(jìn)BMSCs的增殖

12、。沉默NCoR時(shí)，在正常(5.5mmol/L)和高糖（25mmol/L）濃度下，大鼠BMSCs誘導(dǎo)成骨分化，成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的表達(dá)明顯增強(qiáng)。提示NCoR負(fù)性調(diào)控大鼠BMSCs的成骨分化。結(jié)合糖濃度分析，NCoR siRNA可中和高糖對(duì)大鼠BMSCs成骨分化的抑制作用。綜合既往研究，NCoR siRNA能改善機(jī)體胰島素敏感性，NCoR可作為潛在靶點(diǎn)，在糖尿病病人中改善機(jī)體胰島素敏感性，降