大劑量糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的MiroRNA調(diào)控的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　 目前，激素性股骨頭壞死在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head, ONFH)的發(fā)病率中已經(jīng)居于首位，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，致殘率高，造成了極大的社會經(jīng)濟負擔(dān)，但其病因還不是十分清楚?；诓±硌芯?，人們發(fā)現(xiàn)除微循環(huán)障礙導(dǎo)致的毛細血管的微栓塞引起局部骨內(nèi)壓增高，局部缺血壞死外，激素導(dǎo)致的骨髓間充干細胞成骨分化能力的改變，使得骨壞死和修復(fù)平衡打破，繼而導(dǎo)致股骨頭壞死塌陷也是發(fā)病機

2、制重要的環(huán)節(jié)之一。
　　 隨著分子生物學(xué)和表觀遺傳學(xué)的進展，新近的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中起著非常重要的調(diào)控作用，而激素性股骨頭壞死的過程中，激素有可能是通過microRNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的分化潛能而影響骨壞死的發(fā)生或修復(fù)。因此，我們擬通過對骨髓間充質(zhì)干細胞采用不同濃度的地塞米松刺激來尋找差異性表達的microRNA，并進一步驗證其功能，為激素性股骨頭壞死的發(fā)生機制和臨床應(yīng)用干細胞治療提供有

3、力的依據(jù)。
　　 研究目的
　　 1．分離、培養(yǎng)及鑒定MSC；
　　 2．建立大劑量糖皮質(zhì)激素抑制干細胞成骨分化的細胞模型；
　　 3．通過對骨髓間充質(zhì)干細胞采用不同濃度地塞米松刺激，明確其對細胞生長分化的調(diào)控作用；
　　 4．基因芯片篩選不同濃度地塞米松刺激后骨髓間充質(zhì)干細胞的microRNA表達差異，并進行生物信息學(xué)分析，明確其與干細胞成骨分化之間的關(guān)系，尋找可能潛在的關(guān)鍵基因;
　　

4、 5．定制microRNA mimics及inhibitors，完成對microRNA功能驗證。
　　 研究方法
　　 獲取健康成人骨髓，經(jīng)分離、培養(yǎng)、傳代后取得骨髓間充質(zhì)干細胞第三代，以不同濃度地塞米松成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，分別于不同的時間點以ALP、茜素紅染色，觀察細胞增殖及成骨分化能力;脫離成骨誘導(dǎo)體系單純以不同濃度地塞米松干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞48小時，獲取RNA后送檢基因芯片，篩選差異性表達的基因，并進行生

5、物信息學(xué)分析，獲取此調(diào)控途徑中的關(guān)鍵microRNA，定制microRNA mimics及inhibitors，完成對microRNA功能驗證。
　　 研究結(jié)果
　　 1．采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法可以從骨髓中成功分離出骨髓間充質(zhì)干細胞，并通過對細胞形態(tài)的判別，成骨、成脂能力的檢測及相關(guān)的細胞表型鑒定得以證實。
　　 2.10-7mol/L地塞米松成骨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞后，隨著時間的延長，其細胞增殖及成骨

6、分化均較10-9mol/L組差，且細胞成脂肪分化的趨勢明顯增強;相關(guān)成骨基因的檢測結(jié)果顯示：不同濃度地塞米松培養(yǎng)12天左右，骨鈣蛋白、骨橋蛋白、成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2等表達量在10-9mol/L組比10-7mol/L明顯增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．不同濃度的地塞米松可導(dǎo)致的miRNA表達差異，且在同種異體個體之間具有相對一致的表達趨勢，其中miRNA378d/f/g、miRNA1268a/b、mi

7、RNA196a/b等在10-7mol/L明顯上調(diào)，而miRNA422a、miRNA378h/i/c、miRNA29a等則在10-9mol/L組高表達。
　　 4．在具有共同表達趨勢的miRNA中，選取感興趣的miRNA進行生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)miRNA378、miRNA23、miRNA29的靶基因分別是成骨信號調(diào)節(jié)通路上的BMP2、Runx2、DUSP2。
　　 結(jié)論
　　 1．人骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能夠被分