糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分化影響的基礎(chǔ)實驗.pdf

1、前言
　　 糖皮質(zhì)激素具有良好的抗炎、免疫抑制作用,在骨科中對類風(fēng)濕骨性關(guān)節(jié)炎,脊髓損傷有良好的治療效果,臨床上應(yīng)用廣泛。隨著臨床應(yīng)用的增多,缺血性骨壞死發(fā)生率明顯上升,是非創(chuàng)傷性缺血性骨壞死首要誘發(fā)因素,但其引起缺血性壞死的詳細(xì)機理還不是十分清楚。目前糖皮質(zhì)激素引起缺血性骨壞死的發(fā)病機理主要包括:骨髓中脂肪嚴(yán)重蓄積,造成骨內(nèi)高壓,血流灌注降低；血小板增多,粘滯性增大,使髓內(nèi)靜脈瘀滯,骨內(nèi)壓上升,骨內(nèi)血流減少,骨細(xì)胞壞死；間充質(zhì)

2、細(xì)胞受損,成骨細(xì)胞的祖代細(xì)胞來源減少,向成骨、軟骨細(xì)胞分化障礙,骨修復(fù)重建與骨吸收不能維持動態(tài)平衡。其中,對于糖皮質(zhì)激素引起的髓內(nèi)脂肪蓄積是由機體脂肪代謝異常在髓內(nèi)形成的的脂肪沉淀,還是由于激素直接作用于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,使細(xì)胞發(fā)生了脂肪分化以及具體生成的過程目前還沒有定論。
　　 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Cell,BMSC)是存在于骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,能夠分化為中胚層和神

3、經(jīng)外胚層來源的多種組織細(xì)胞,包括成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。研究報道,體外培養(yǎng)的BMSC可以在體外、體內(nèi)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化,且這種分化會隨著體內(nèi)外微環(huán)境的變化而發(fā)生改變,而糖皮質(zhì)激素對細(xì)胞的成骨和脂肪分化有著顯著影響。
　　 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在向各種組織細(xì)胞分化中受多種因子的調(diào)控,目前已知的調(diào)控細(xì)胞成骨分化的關(guān)鍵因子(Runx2)和脂肪分化早期的特異性因子(PPARγ-2)的出現(xiàn)與表達(dá)的變化,均能夠客觀反應(yīng)骨髓

4、間充質(zhì)細(xì)胞分化進(jìn)程,決定骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分化方向。本課題通過地塞米松對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞脂肪分化和成骨分化的影響,探討糖皮質(zhì)激素引起骨壞死的發(fā)生機理,闡述骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的脂肪生成在非創(chuàng)傷缺血性骨壞死發(fā)生中的作用和影響。并通過進(jìn)一步觀察糖皮質(zhì)激素對Runx2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成脂分化作用,探討成骨調(diào)控基因過表達(dá)時,糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化作用的效果。
　　 立題一:糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化的作用
　　 骨髓間

5、充質(zhì)細(xì)胞具有多向分化潛能,在不同的培養(yǎng)條件下,能夠分化成多種組織和細(xì)胞,在體外正常培養(yǎng)中,大多數(shù)BMC能夠分化為成骨細(xì)胞。本實驗以劑量和時間方式觀察地塞米松對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響,同時觀察地塞米松對細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)學(xué)上的顯微及超微變化的影響。
　　 立題二:地塞米松影響骨髓間充質(zhì)細(xì)胞Runx2和PPARγ-2基因的表達(dá)
　　 基因Runx2是調(diào)控骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨分化的關(guān)鍵性因子；PPARγ-2是脂肪細(xì)胞早期

6、特異性標(biāo)志因子?；虮磉_(dá)的不同代表了細(xì)胞分化方向的不同。本立題通過檢測成骨基因(Runx2)和成脂基因(PPARγ-2)mRNA和蛋白的表達(dá),闡述地塞米松在基因和蛋白水平上對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響。
　　 立題三:上調(diào)Runx2對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成脂分化的抑制作用
　　 在糖皮質(zhì)激素促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞脂肪分化,抑制成骨分化過程中,成骨基因Runx2表達(dá)減少,成脂基因PPARγ-2表達(dá)增高。如何拮抗糖皮質(zhì)激素對

7、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的這種作用,從而為臨床上應(yīng)用糖皮質(zhì)激素引起的缺血性骨壞死找到解決方法。本立題利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),檢測Runx2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后,成骨標(biāo)志性因子(ALP、Col Ⅰ和OCN)基因mRNA的表達(dá),探討大劑量糖皮質(zhì)激素對基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞成脂分化的作用。
　　 材料與方法
　　 立題一:糖皮質(zhì)激素對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化的作用
　　 1、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　 取3-4周齡SD大鼠雙側(cè)股

8、骨和脛骨,10％FBS低糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,過濾,離心,培養(yǎng),0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。
　　 2、堿性磷酸酶染色和SudanⅢ復(fù)染
　　 含有不同濃度地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,堿性磷酸酶、SudanⅢ復(fù)染,觀察SudanⅢ染色的脂肪細(xì)胞和堿性磷酸酶染色陽性成骨細(xì)胞數(shù)量變化的關(guān)系。
　　 3、細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化
　　 倒置相差光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察地塞米松刺激后,細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)上

9、的顯微及超微變化。
　　 4、細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測
　　 改良的Kaplow氏法檢測:分別以劑量方式和時間方式的地塞米松對細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響,比較不同組別的吸光度值差異。
　　 5、MTT方法檢測地塞米松對細(xì)胞增殖的影響:檢測各組細(xì)胞的吸光度值,比較不同濃度地塞米松對細(xì)胞增殖能力的抑制效果。
　　 立題二:地塞米松對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞Runx2和PPARγ-2基因表達(dá)的影響
　　 1、運用Re

10、al-Time PCR方法,檢測成骨基因(Runx2)和脂肪基因(PPARγ-2)mRNA的表達(dá):比較不同濃度地塞米松對骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化的作用。
　　 2、Western blot印跡法檢測成骨分化Runx2蛋白的表達(dá):從蛋白表達(dá)變化上說明大劑量地塞米松抑制骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。
　　 立題三:上調(diào)Runx2對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成脂分化的抑制作用
　　 1、構(gòu)建pCMV/flag-Runx2質(zhì)粒<

11、br>　　 2、pCMV/flag-Runx2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,分別采用Western blot印跡和RT-PCR法以及免疫熒光化學(xué)方法確定重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染是否成功。
　　 3、通過RT-PCR方法檢測Runx2基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)細(xì)胞后,成骨分化標(biāo)志性基因(ALP、Col Ⅰ、OCN)和脂肪分化基因(PPARγ-2、aP2)的mRNA表達(dá)；同時在高表達(dá)Runx2基因的情況下,大劑量地塞米松對上述基因表達(dá)的影響。
　　

12、4、Western blot印跡測定地塞米松對Runx2基因轉(zhuǎn)染后,骨髓間充質(zhì)細(xì)胞骨鈣素表達(dá)的影響。
　　 實驗結(jié)果
　　 1、地塞米松刺激后,細(xì)胞形態(tài)和排列發(fā)生變化,早期,細(xì)胞由梭型變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則性,出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)聚,改變其致密的排列,團(tuán)聚的細(xì)胞折光性增強。后期,細(xì)胞團(tuán)聚現(xiàn)象消失,細(xì)胞形態(tài)呈圓型,細(xì)胞稀疏。
　　 2、隨著地塞米松濃度增高,細(xì)胞內(nèi)SundanⅢ著色的脂肪顆粒明顯增加
　　 3、對照組的堿

13、性磷酸酶活性與10-810-710-6M的地塞米松中,增高分別為1.57,4.49,5.0倍。
　　 4、電鏡顯示:細(xì)胞核縮小,核膜皺折增多,核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生固縮,電子密度增強,胞質(zhì)明顯減少。
　　 5、地塞米松減少Runx2的表達(dá)88-37％(P<0.05),增加PPARγ-2的表達(dá)108-230％(P<0.05)；明顯減少Runx2蛋白表達(dá),(P<0.05)。
　　 6、.Runx2基因轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞Runx2m

14、RNA表達(dá)增加257％(P<0.05),下游成骨基因的表達(dá)增加明顯(P<0.05)；PPARγ-2的表達(dá)減少76％(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、地塞米松促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的脂肪分化,抑制成骨分化。
　　 2、地塞米松通過減少成骨調(diào)控因子Runx2,增加脂肪分化因子PPARγ-2的基因和蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞脂肪分化,抑制其成骨分化。
　　 3、Runx2基因修飾的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞對地塞米松的促脂分化