SIRT1激活對(duì)Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化及高血壓的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈硬化和高血壓病是常見(jiàn)的心血管疾病，發(fā)病率隨年齡增加而增加，嚴(yán)重威脅老年人群的生活和健康。根據(jù)JNC-7（Seventh Report of the Joint National Committee）的報(bào)道，三分之二65歲以上的老年人患有高血壓病。動(dòng)脈硬化是隨著年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)的血管疾病，其病理基礎(chǔ)為大血管壁中彈性纖維逐漸斷裂、丟失伴隨膠原纖維逐漸積聚，使動(dòng)脈管壁增厚、變硬，進(jìn)而失去彈性。動(dòng)脈硬化是心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，且其發(fā)生獨(dú)立

2、于動(dòng)脈粥樣硬化的形成。動(dòng)脈硬化和高血壓有著密切的聯(lián)系，有研究表明動(dòng)脈硬化的形成可預(yù)測(cè)收縮壓的增高。本課題組近期研究顯示Klotho基因缺陷誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化的形成先于高血壓的發(fā)生，然而，其機(jī)制尚不完全清楚。本文運(yùn)用Klotho基因缺陷雜合子小鼠作為老年動(dòng)物模型，分為以下三部分對(duì)Klotho和SIRT1的關(guān)系及其在動(dòng)脈硬化和高血壓的形成機(jī)制中的作用進(jìn)行初步研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：Klotho基因缺陷抑制主動(dòng)脈SIRT1活

3、性和蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化及高血壓形成。
　　目的：檢測(cè)動(dòng)脈硬化伴有高血壓患者循環(huán)血中抗衰老基因 Klotho蛋白含量，證實(shí)動(dòng)脈硬化伴有高血壓患者血中Klotho蛋白水平降低；檢測(cè)Klotho對(duì)主動(dòng)脈中SIRT1活性及蛋白表達(dá)量和對(duì)血壓及大動(dòng)脈彈性的影響，證實(shí)Klotho參與高血壓及動(dòng)脈硬化的形成，此效應(yīng)與其抑制主動(dòng)脈中SIRT1活性及其蛋白表達(dá)相關(guān)。
　　方法：⑴收集動(dòng)脈硬化伴有高血壓患者相關(guān)臨床資料及血清標(biāo)本， ELIS

4、A法檢測(cè)血清中Klotho蛋白水平。⑵構(gòu)建Klotho基因缺陷雜合子小鼠動(dòng)物模型。⑶采用脈搏波傳導(dǎo)速度法監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)脈彈性變化。⑷采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓檢測(cè)法監(jiān)測(cè)小鼠血壓（blood pressure, BP）變化。⑸采用免疫印跡法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈SIRT1活性及蛋白表達(dá)量的改變。⑹采用免疫印跡法檢測(cè)檢測(cè)小鼠血漿中Klotho蛋白含量。
　　結(jié)果：①ELISA結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，動(dòng)脈硬化及高血壓患者血清中Klotho蛋白含量降低約

5、45％（P<0.05）。臨床基線資料結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，動(dòng)脈硬化及高血壓患者組baPWV和BP顯著性升高（P<0.001）；而兩組間年齡、體重指數(shù)、血糖、血脂、血肌酐水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②采用超聲多普勒法檢測(cè)小鼠胸主動(dòng)脈-腹主動(dòng)脈脈搏波傳導(dǎo)速度（Pulse wave velocity, PWV）以評(píng)價(jià)小鼠大動(dòng)脈彈性。經(jīng)過(guò)為期3個(gè)月的監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Klotho基因缺陷小鼠PWV持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.00

6、1），此結(jié)果提示Klotho基因缺陷能誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化形成。同時(shí)，我們采用無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓檢測(cè)法監(jiān)測(cè)小鼠血壓變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PWV結(jié)果一致，同對(duì)照組比較，KL+/-小鼠血壓顯著且持續(xù)性升高（P<0.001），表明Klotho基因缺陷能誘導(dǎo)高血壓形成。③免疫印跡法結(jié)果顯示，與 WT組相比，KL+/-小鼠主動(dòng)脈中 SIRT1蛋白含量及活性均顯著性降低（P<0.05），提示 Klotho基因缺陷下調(diào)主動(dòng)脈中SIRT1蛋白活性及表達(dá)量。④小鼠循

7、環(huán)血中Klotho蛋白含量檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，KL+/-小鼠血漿中Klotho蛋白水平顯著性降低，提示此動(dòng)物模型能有效模擬動(dòng)脈硬化及高血壓患者的機(jī)體內(nèi)環(huán)境。
　　結(jié)論：Klotho基因缺陷誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化及高血壓的形成，同時(shí)抑制主動(dòng)脈中SIRT1活性及蛋白表達(dá)量。
　　第二部分：SIRT1激活改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化及高血壓。
　　目的：探討SIRT1激活對(duì)大動(dòng)脈彈性及血壓的干預(yù)，證實(shí)SIRT1激活可顯著

8、改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化及高血壓。
　　方法：⑴采用SIRT1激活劑SRT1720對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，劑量為15mg/kg/d，共19天，對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水。⑵藥物干預(yù)過(guò)程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠 PWV和 BP變化，藥物干預(yù)19天后，在麻醉狀態(tài)下采用經(jīng)導(dǎo)管有創(chuàng)血壓檢測(cè)法直接測(cè)量主動(dòng)脈血壓，以確認(rèn)無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓結(jié)果。⑶檢測(cè)血漿Klotho蛋白含量。⑷采用免疫組化及免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈SIRT1活性、蛋白含量及其在主

9、動(dòng)脈細(xì)胞中的分布情況。⑸采用Masson's trichrome染色法檢測(cè)主動(dòng)脈壁中膠原纖維的變化，免疫印跡法測(cè)定主動(dòng)脈中I型膠原蛋白的含量。⑹采用Verhoeff's彈性纖維染色法檢測(cè)主動(dòng)脈壁中彈性纖維的變化，免疫印跡法測(cè)定主動(dòng)脈中彈性蛋白的含量。
　　結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1激活劑干預(yù)后第6天，KL+/-組小鼠PWV值即顯著下降（P<0.01 vs KL+/-+Saline），恢復(fù)至WT組水平。SRT1720干預(yù)并未影

10、響正常對(duì)照組的PWV水平。此結(jié)果提示，SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化。②無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定結(jié)果顯示， Klotho基因缺陷組小鼠血壓在SRT1720干預(yù)后第3天開(kāi)始顯著性降低（P<0.001 vs KL+/-+Saline），干預(yù)后第6天降至WT組水平。SIRT1激活劑干預(yù)并未影響WT小鼠的BP水平。有創(chuàng)主動(dòng)脈血壓檢測(cè)驗(yàn)證了這一結(jié)果。此結(jié)果提示，SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的高血壓，但并不

11、影響正常血壓。③免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SRT1720治療組的 KL+/-小鼠血漿中 Klotho蛋白含量無(wú)變化，提示 SIRT1激活并不影響循環(huán)血中Klotho水平，故SIRT1激活至少不能直接調(diào)控Klotho蛋白的表達(dá)。④免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)SRT1720干預(yù)后，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈SIRT1活性顯著性升高（P<0.01 vs KL+/-+ Saline），恢復(fù)至 WT組水平。免疫組化結(jié)果顯示，SIRT1在主

12、動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，絕大多數(shù)分布在細(xì)胞核內(nèi)。半定量分析顯示，與WT組相比，SIRT1蛋白在 KL+/-組小鼠主動(dòng)脈的內(nèi)膜和中膜上的表達(dá)量均顯著性減少（P<0.01 vs WT+Saline），經(jīng)SRT1720干預(yù)后，SIRT1在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增多（P<0.01 vs KL+/-+Saline），此結(jié)果與免疫印跡結(jié)果完全吻合。提示 SRT1720對(duì) SIRT1的激活效應(yīng)可能是通過(guò)上調(diào)其蛋白表達(dá)量實(shí)現(xiàn)

13、的。⑤SIRT1激活顯著改善由Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)改變，增加彈性蛋白表達(dá)，減少I型膠原蛋白表達(dá)。Masson's trichrome染色和Verhoeff's彈性纖維染色法結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈壁中膠原沉積量顯著增加（P<0.01），與之伴隨的是主動(dòng)脈壁中彈力板的斷裂數(shù)量明顯降低，為Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。免疫印跡法結(jié)果顯示，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈中I型膠原蛋白的表達(dá)量

14、明顯增加（P<0.05），伴有彈性蛋白的表達(dá)顯著性降低（P<0.01）。經(jīng)SRT1720治療后，上述動(dòng)脈硬化相關(guān)變化被顯著性改善（P<0.05），與WT組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示SIRT1活化通過(guò)調(diào)控主動(dòng)脈中I型膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)量，改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化相關(guān)的主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)重塑。
　　結(jié)論：SIRT1激活能顯著性改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化和高血壓，但不影響血漿Klotho水平。
　　第三部分：SI

15、RT1激活改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化及高血壓機(jī)制的研究。
　　目的：探討SIRT1激活改善Klotho基因缺陷誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化及高血壓的機(jī)制，證實(shí)此效應(yīng)系通過(guò)SIRT1上調(diào)主動(dòng)脈中AMPKα和eNOS的活性，抑制NADPH氧化酶和超氧化物生成而實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：⑴采用免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈中磷酸化 AMPKα（ phosphorated- AMPKα, p-AMPKα）和總 AMPKα（ total- A

16、MPKα, t-AMPKα）的表達(dá)。⑵采用免疫組化和免疫印漬法檢測(cè)主動(dòng)脈中磷酸化 eNOS（phosphorated-eNOS, p-eNOS）和總eNOS（total-eNOS, t-eNOS）的表達(dá)。⑶采用lucigenin化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)主動(dòng)脈中NADPH氧化酶活性。⑷采用DHE染色檢測(cè)主動(dòng)脈中超氧化物的含量。
　　結(jié)果：①免疫印跡結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈中p-AMPKα蛋白含量顯著降低（P<0.001

17、vs WT+Saline），而t-AMPKα含量無(wú)明顯差異，提示Klotho基因缺陷抑制了主動(dòng)脈中AMPKα活性。SRT1720干預(yù)后，p-AMPKα蛋白含量明顯增高（P<0.001 vs KL+/-+Saline），而t-AMPKα蛋白表達(dá)量未受影響，此結(jié)果表明，SIRT1活化可使主動(dòng)脈AMPKα活性顯著增高。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了p-AMPKα和t-AMPKα在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，二者在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，其中，在內(nèi)

18、皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均可見(jiàn)陽(yáng)性染色，而在平滑肌細(xì)胞中則主要表達(dá)在細(xì)胞漿中。半定量分析結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致，提示Klotho基因缺陷顯著性抑制了主動(dòng)脈中AMPKα活性，SIRT1激活劑治療后可解除此抑制效應(yīng)。②同AMPKα相似，免疫印跡結(jié)果顯示，與WT組相比，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈中p-eNOS蛋白含量顯著降低（P<0.001 vs WT+Saline），而t-eNOS蛋白含量無(wú)明顯差異，提示 Klotho基因缺陷抑制了主動(dòng)脈中eN

19、OS活性。經(jīng)SRT1720干預(yù)后，p-eNOS蛋白含量明顯升高（P<0.001 vs KL+/-+Saline），而t-eNOS蛋白表達(dá)量未受影響，因此，SIRT1激活可顯著增加主動(dòng)脈eNOS活性。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，在細(xì)胞中的分布情況為：p-eNOS和eNOS均僅在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)。提示SIRT1激活可顯著改善Klotho基因缺陷對(duì)主動(dòng)脈中eNOS活性的抑制。③lucigenin化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)顯示，與 WT組相比，K

20、L+/-組小鼠主動(dòng)脈中NADPH氧化酶活性顯著增加（P<0.05 vs WT+Saline），提示Klotho基因缺陷誘導(dǎo)了主動(dòng)脈中NADPH氧化酶活化。經(jīng)SRT1720干預(yù)后， NADPH氧化酶活性明顯降低（P<0.05 vs KL+/-+Saline），與WT組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④DHE染色實(shí)驗(yàn)顯示，KL+/-組小鼠主動(dòng)脈中超氧化物含量較WT組顯著性增加（P<0.001 vs WT+Saline），提示Klotho基因缺陷誘導(dǎo)了主動(dòng)脈中