基于腸道菌群靶點(diǎn)的猴頭菌蛋白免疫活性研究.pdf

1、目的:通過(guò)建立特定細(xì)胞和動(dòng)物模型，給予猴頭菌蛋白(Hericium erinaceus proteinHEP)處理后，觀察HEP對(duì)免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，從而對(duì)其免疫活性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，同時(shí)檢測(cè)模型動(dòng)物中腸道菌群的變化，進(jìn)而探究猴頭菌蛋白、腸道菌群和免疫三者之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用響應(yīng)面法，以提取液料比、pH、溫度和時(shí)間為篩選指標(biāo)，優(yōu)選猴頭菌水溶性蛋白的最佳提取工藝，并采用SDS-PAGE電泳法，按照其分子大小確

2、定猴頭菌總蛋白的組成。
　　2.通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，給予HEP后，評(píng)價(jià)其對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖作用和1μg/mL脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7炎癥模型細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3.小鼠腹腔注射80mg/kg的環(huán)磷酰胺(CTX)制備免疫低下模型，HEP高劑量組(HEP-G)和低劑量組(HEP-D)小鼠分別灌胃給以200 mg/kg/d和100mg/kg/d的HEP溶液，觀察小鼠免疫相關(guān)生理、病理

3、指標(biāo)的改變;同時(shí)收集盲腸內(nèi)容物，采用16s RNA測(cè)序檢測(cè)腸道微生物組成。
　　4.采用三硝基苯磺酸（TNBS，0.6％的濃度，0.1ml每只灌腸）造小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型后，其中半數(shù)模型小鼠服用過(guò)量混合抗生素處理;二類(lèi)模型小鼠均隨機(jī)分為三組，分別灌胃給予100mg/kg/d HEP溶液、雙歧桿菌制劑（約含50億活菌）及HEP和雙歧桿菌復(fù)合溶液，觀察不同處理組小鼠結(jié)腸處炎癥和潰瘍病變狀況，同時(shí)采用16sRNA測(cè)序檢測(cè)腸道微生物組成。

4、
　　結(jié)果:1.響應(yīng)面法確定HEP最佳提取條件為pH=9.47、最佳液料比50ml/g、最優(yōu)控制溫度為37.9℃、提取時(shí)間是6h，最佳提取率為31.81mg/g; SDS-PAGE電泳圖顯示，蛋白共有6個(gè)條帶主要集中在37-90KD之間。
　　2.將HEP作用于RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)48h，在1.250-0.063mg/mL給藥濃度下，HEP均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，且隨濃度降低，細(xì)胞增殖促進(jìn)率不斷提升。LPS造

5、炎癥模型后，細(xì)胞TNF-α，IL-1β以及IL-6因子的表達(dá)明顯增加(p＜0.05)，隨著HEP給藥濃度從0.05mg/mL增加到0.2mg/mL，上述炎癥因子的表達(dá)量呈減小趨勢(shì)(p＜0.05);給藥HEP后，隨著給藥濃度增加，細(xì)胞NO、iNOS和NF-κB分泌量不斷減少，且與模型組相比，0.10mg/mL及0.20mg/mL濃度下各因子分泌水平差異顯著(p＜0.01)。
　　3.小鼠注射環(huán)磷酰胺后造模后，其胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、白

6、細(xì)胞和血小板數(shù)目均明顯降低(p＜0.05)，給藥HEP后，上述指標(biāo)均有明顯提升，其中低劑量組(100mg/kg/d)組呈顯著性差異(p＜0.01);造模后，腹腔巨噬細(xì)胞中性紅吞噬值、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均降低(p＜0.05)，給藥HEP后，中性紅吞噬值與模型組相比有明顯提升，HEP低劑量組呈顯著性差異(p＜0.01)，HEP組小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激增殖率達(dá)175％，已結(jié)接近正常組，且灌胃HEP后小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD28

7、+、CD4+/CD8+、CD28+/CD8+和初始T細(xì)胞值均增大。脾臟病理切片顯示，HEP能改善CTX導(dǎo)致的脾臟萎縮和病變。小鼠造模后，腸道變形菌門(mén)、膜菌門(mén)、和TM17菌門(mén)菌數(shù)增加，而擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)菌數(shù)則相應(yīng)的減少;給藥HEP后，小鼠腸道放線菌門(mén)，膜菌門(mén)，變形菌門(mén)數(shù)下降，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)菌數(shù)上升，與空白組較為接近。從屬水平分類(lèi)上看，模型組高豐度菌主要為勞特氏菌屬、理研菌屬及鞘脂單胞菌，HEP組高豐度菌群主要為腸桿菌屬及棒狀桿菌屬。

8、
　　4.血清中LPS水平測(cè)定結(jié)果顯示，模型組與模型+抗生素處理組含量分別是正常組的210％和240％。給藥HEP和雙歧桿菌制劑后，小鼠血清中LPS水平皆有明顯下降，HEP+雙歧桿菌組血清中LPS含量?jī)H增長(zhǎng)20％左右。與正常組相比，TNBS模型組病理上呈現(xiàn)嚴(yán)重的潰瘍和炎癥病變，炎癥因子TNF-α、VGEF-α、1L-17α、INF-γ和LPS分泌量明顯增高;經(jīng)HEP和益生菌處理后，該五種因子分泌值降低明顯，GM-CSF、1L-10

9、、IL-12、1L-4抗炎因子分泌量提升，且結(jié)腸中Foxp3表達(dá)增加NF-κB p65的表達(dá)減少。且HEP+雙歧桿菌效果好于單純給藥HEP和給雙歧桿菌;HEP處理后腸道菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上已經(jīng)表現(xiàn)出不同，腸道內(nèi)放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和TM7門(mén)細(xì)菌增多，脫鐵桿菌門(mén)和變形菌門(mén)細(xì)菌減少;與TNBS組相比，給藥HEP、雙歧桿菌和HEP+雙歧桿菌后，小鼠腸道內(nèi)擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)菌數(shù)明顯增多，特別是雙歧桿菌屬菌的豐度有明顯的提升(p＜0.05）

10、。
　　結(jié)論:一定濃度下，HEP能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖。HEP能通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α，IL-1β以及IL-6的超量分泌，并且通過(guò)抑制通路上iNOS因子以及NF-κB的過(guò)量表達(dá)，從而達(dá)到抑制NO的分泌的效應(yīng)，進(jìn)而緩解LPS所致的RAW264.7細(xì)胞炎癥的惡化。免疫低下模型小鼠給藥HEP后，免疫相關(guān)的各項(xiàng)生理病理指標(biāo)都得到一定的改善，小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌結(jié)構(gòu)恢復(fù)，菌群多樣性較好。過(guò)量抗生素導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)破壞后，能夠?qū)е滦?/p>