猴頭菌菌絲體糖蛋白結(jié)構(gòu)解析及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、猴頭菌(Hericium erinaceus)隸屬于多孔菌目，猴頭菌科，有很高的營養(yǎng)價(jià)值，可用于治療胃炎、胃和十二指腸潰瘍等疾病，其活性成分包括多糖、糖蛋白（肽）復(fù)合物、猴頭菌酮和芳香族類化合物等，多數(shù)具有抗腫瘤、抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性和降血糖功能。本論文基于前期研究，從猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體中純化出一種具有凝集活性和抗腫瘤活性的糖蛋白，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特性、凝集活性及其抗腫瘤作用的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下:
　　(

2、1)以猴頭菌菌絲體為提取原料，采用水提、鹽析等方法獲得其菌絲體糖蛋白，采用DEAE-Sepharose Fast Flow層析和SuperdexTM75預(yù)裝柱對(duì)粗提物進(jìn)行純化，并采用人胃癌SGC-7901細(xì)胞對(duì)HEG-1、HEG-3和HEG-5進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，確定出HEG-5為抑制SGC-7901細(xì)胞增殖最強(qiáng)的組分。SDS-PAGE、Native-PAGE和MALDI-TOF-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HEG-5為一不含有亞基的相對(duì)分子量約為

3、14400的糖蛋白。IEF電泳測(cè)定其等電點(diǎn)為6.3;苯酚硫酸法和BCA法測(cè)定了HEG-5樣品中糖含量和蛋白含量分別為8.86％和86.67％;氣相色譜法測(cè)定HEG-5的單糖組成為D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖和D-甘露糖，摩爾比為1.00∶1.09∶2.45∶7.14;對(duì)HEG-5氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其由17種氨基酸組成，天冬氨酸和谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。分析以上結(jié)果可知，HEG-5是一種微觀非均一的酸性糖蛋白。
　　(2)圓

4、二色譜分析發(fā)現(xiàn)HEG-5含有13.9％α-螺旋、56.5％β-折疊和29.6％無規(guī)卷曲，表明HEG-5是一種以β-折疊結(jié)構(gòu)為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的糖蛋白。熱穩(wěn)定性分析可知HEG-5是一種熱不穩(wěn)定糖蛋白，70℃以上的溫度處理后，HEG-5完全喪失其體外抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的作用;40-60℃處理后，HEG-5的凝集活性減半，90℃以上處理后，其凝集活性完全喪失;隨著處理溫度從30℃升高到100℃，其α-螺旋和β-折疊所占比例均降低，而β-

5、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的所占比例均上升，提示HEG-5中具有生物活性的結(jié)構(gòu)單元可能為蛋白鏈。紅外光譜和核磁共振的1H譜結(jié)果表明HEG-5的糖鏈結(jié)構(gòu)可能存在β-葡萄糖、(1→4)-β-半乳糖殘基等基團(tuán)。MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)，HEG-5與peptidaseM23[Halomonas sp.HAL1](gi|496245751)的氨基酸序列覆蓋率為20％;MS/MS分析結(jié)果顯示HEG-5與hypothetical protein[Baci

6、llus cereus](gi|446583541)的匹配度較高，結(jié)合SWISS-MODEL Workplace軟件初步預(yù)測(cè)了HEG-5可能的3D分子模型。
　　(3)對(duì)HEG-5體外抑制SGC-7901細(xì)胞增殖及其作用機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究。隨著HEG-5濃度從0μg/mL增大到80μg/mL，不規(guī)則的SGC-7901細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，圓形細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，貼壁能力下降。掃描電鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常SGC-7901細(xì)胞的表面布滿絲狀

7、微絨毛，隨著HEG-5濃度逐漸增大，SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，表面微絨毛變少，并伴隨有突起小泡和凋亡小體的出現(xiàn)。Hoechst實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)HEG-5處理的對(duì)照組經(jīng)染色后呈正常藍(lán)色，具有完整的細(xì)胞形態(tài);隨著HEG-5濃度的增加，碎片狀細(xì)胞開始出現(xiàn)，細(xì)胞核發(fā)生高度凝聚并形成凋亡小體。彗星電泳研究表明，未經(jīng)HEG-5處理的正常的SGC-7901細(xì)胞的核DNA經(jīng)EB染色后呈圓形或近圓形;當(dāng)HEG-5濃度從20μg/mL增大到80μg

8、/mL時(shí)，核DNA的損傷程度更加嚴(yán)重。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著HEG-5濃度的增加，處于早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞的比例均逐漸增大。細(xì)胞周期分布結(jié)果表明，HEG-5作用后的SGC-7901細(xì)胞阻滯于S期，從而受到抑制。熒光定量PCR、DNA-PAGE和Westem blot等結(jié)果表明，HEG-5誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡主要通過上調(diào)細(xì)胞中p53、Bad、Bax、Caspase8、Caspase3的表達(dá)水