SPINK3調(diào)節(jié)大鼠正常肝細(xì)胞BRl-3A增殖的分子機(jī)理研究.pdf

1、研究表明,絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅲ(serine peptidase inhibitor, Kazal type3,SPINK3)不僅是一種胰蛋白酶抑制劑,而且是一類結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)相似的信號(hào)分子,能夠與EGFR結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)室在研究大鼠肝再生功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)SPINK3在大鼠再生肝中表達(dá)顯著增強(qiáng)。同時(shí),有文獻(xiàn)報(bào)道其與大鼠腸上皮細(xì)胞IEC-6的細(xì)胞增殖密切相

2、關(guān)。然而,SPINK3對(duì)肝細(xì)胞增殖、肝再生的作用和調(diào)控機(jī)制尚未有人報(bào)道。為此,本課題擬深入研究SPINK3調(diào)控大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A增殖的分子機(jī)理。
　　為了解SPINK3在大鼠肝再生中調(diào)控肝細(xì)胞增殖的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)理,本文用大鼠全基因組芯片Rat Genome2302.0檢測(cè)部分肝切除后再生肝的基因表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)SPINK3在部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后2-24 h和72-168 h表達(dá)顯著

3、上調(diào),其促進(jìn)細(xì)胞增殖的過(guò)程基本與大鼠肝再生進(jìn)程相符,本文用qRT-PCR和Western Blot驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。結(jié)合文獻(xiàn)資料用IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0,IPA)軟件構(gòu)建SPINK3調(diào)控肝再生的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)并分析其可能的作用機(jī)理,表明SPINK3可與EGFR結(jié)合,通過(guò)p38MAPK、PKC、JAK-STAT和AKT等四條信號(hào)通路調(diào)控肝細(xì)胞增殖,進(jìn)一步分析表明,上述四條信號(hào)通路均對(duì)細(xì)胞增殖起

4、到促進(jìn)作用。綜上所述,SPINK3在大鼠肝再生中可能通過(guò)上述信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)肝臟再生。
　　為驗(yàn)證上述推測(cè),本文用基因添加和干涉的方法處理BRL-3A細(xì)胞,對(duì)SPINK3調(diào)節(jié)BRL-3A細(xì)胞增殖的分子機(jī)理進(jìn)行了初步研究。本文首先構(gòu)建了SPINK3的過(guò)表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-SPINK3,包裝慢病毒后侵染BRL-3A細(xì)胞,篩選出陽(yáng)性單克隆,以獲得能夠穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SPINK3的BRL-3A

5、細(xì)胞。同時(shí)設(shè)計(jì)并合成了兩條SPINK3特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BRL-3A細(xì)胞后,運(yùn)用qRT-PCR篩選出最佳干涉片段,進(jìn)而獲得干涉SPINK3表達(dá)的BRL-3A細(xì)胞。MTT法分析SPINK3表達(dá)變化對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響,結(jié)果顯示SPINK3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞在24、48、72和96 h的細(xì)胞活性均比其對(duì)照組高;而轉(zhuǎn)染siRNA1后,BRL-3A細(xì)胞在48和72

6、 h細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。通過(guò)BrdU摻入法分析干涉SPINK3表達(dá)對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)siRNA1轉(zhuǎn)染BRL-3A細(xì)胞后48 h細(xì)胞增殖明顯受到抑制;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SPINK3表達(dá)變化對(duì)BRL-3A細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SPINK3基因?qū)RL-3A細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,對(duì)BRL-3A細(xì)胞凋亡有顯著抑制作用(P＜0.05);而干涉SPINK3基因表達(dá)則顯著抑制BRL-3A細(xì)胞增殖(P＜0.05),促進(jìn)BR

7、L-3A細(xì)胞凋亡。用qRT-PCR和Western Blot等方法檢測(cè)上述材料的SPINK3及其受體EGFR和相應(yīng)信號(hào)通路的相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化,進(jìn)而分析大鼠肝再生中SPINK3調(diào)控肝細(xì)胞增殖的機(jī)理。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)SPINK3時(shí),SPINK3信號(hào)通路基因ERK1、AKT1、STAT3,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB1及其下游靶基因CCND1等表達(dá)上調(diào);siRNA干涉SPINK3表達(dá)時(shí),這些基因和蛋白表達(dá)下調(diào)。由此得出結(jié)論,SPINK3通過(guò)調(diào)節(jié)