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文檔簡介
1、作為一種胰蛋白酶抑制劑,絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅰ(serine peptidase inhibitor, Kazaltype1,SPINK1)的空間結(jié)構(gòu)與表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)的非常相似。研究表明,SPINK1的生物學(xué)功能也類似于EGF,能夠促進正常細胞和癌細胞的增殖和分化。本實驗室采用大鼠全基因組芯片Rat Genome2302.0檢測2/3部分肝切除(partial hepatectom
2、y, PH)后再生肝肝細胞的基因表達譜,發(fā)現(xiàn)Spink1在肝切除后的6、24和72 h表達顯著上調(diào)。眾所周知PH后6-72 h肝細胞增殖明顯,表明Spink1與大鼠再生肝肝細胞的增殖密切相關(guān)?;蚪M芯片檢測二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DENA)誘導(dǎo)的大鼠肝癌細胞的基因表達譜,發(fā)現(xiàn)Spink1在誘導(dǎo)后的12和16w表達顯著上調(diào),并且誘導(dǎo)后12-16w肝細胞增殖明顯,表明Spink1與大鼠肝癌細胞的增殖密切相關(guān)。然而
3、,目前對SPINK1調(diào)控肝再生中肝細胞,以及肝癌細胞增殖的機理還不完全清楚。研究表明,SPINK1能夠與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)相結(jié)合,調(diào)控細胞的增殖、分化和遷移等多種生理活動。本文通過免疫共沉淀(immunoprecipitation assay, IP)的方法也發(fā)現(xiàn)SPINK1能夠與EGFR相結(jié)合。最近的研究表明EGFR被生長因子等激活后,能夠通過p38MAPK、
4、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多條信號通路促進細胞的增殖。本文通過IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0)軟件,結(jié)合相關(guān)文獻分析SPINK1與EGFR信號通路的互作網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)SPINK1可能與EGFR結(jié)合后通過上述6條信號通路調(diào)控細胞的增殖。
本研究通過基因添加的方法處理BRL-3A細胞,并用重組蛋白處理BRL-3A細胞和RH-35細胞,通過MTT、EdU、流式細胞術(shù)等方法檢測S
5、PINK1上調(diào)表達對上述兩種細胞活力、增殖和周期等的影響,通過免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推測SPINK1調(diào)控兩種細胞增殖的機理。結(jié)果表明,通過基因添加的方法上調(diào)BRL-3A細胞內(nèi)源性Spink1的表達后,細胞的生長活力和增殖,S期和G2/M期的細胞數(shù)量,細胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達都明顯增加,然而,G1期的細胞數(shù)量和促凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達都明顯減少。通過qRT-PCR和western blot
6、等方法檢測SPINK1信號通路相關(guān)基因/蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)p38,ERK和JNK信號通路相關(guān)基因/蛋白的表達發(fā)生顯著的變化。當用外源性的重組大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)處理BRL-3A細胞時,所得到的結(jié)果與上述結(jié)果相似。當用rrSPINK1處理RH-35細胞時,我們發(fā)現(xiàn)與處理BRL-3A細胞所得到的結(jié)果相似,RH-35細胞的生長活力和增殖,S期和G2/M期的細胞數(shù)量,細胞增殖和抗凋
7、亡相關(guān)基因/蛋白的表達都明顯提高,G1期的細胞數(shù)量和凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達都明顯減少。qRT-PCR和western blot檢測結(jié)果表明,在RH-35細胞中,p38和JAK-STAT3信號通路相關(guān)基因/蛋白的表達發(fā)生顯著的變化。本文用pEGFR抗體處理穩(wěn)定表達內(nèi)源性Spink1的陽性單克隆BRL-3A細胞發(fā)現(xiàn),該細胞的生長活力受到明顯的抑制,并且抑制效果隨著抗體劑量的增加愈加明顯,進一步驗證了SPINK1與EGFR結(jié)合后發(fā)揮其相應(yīng)的
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