rHSa-ONC促進(jìn)大鼠肝癌細(xì)胞RH-35凋亡的研究.pdf

1、豹蛙抗瘤酶(Onconase，ranpirnase，ONC)是一種天然的蛋白質(zhì)，提取于北極豹蛙的卵母細(xì)胞和早期胚胎中，它有很強(qiáng)的殺傷力，在體內(nèi)外的許多腫瘤試驗(yàn)中都得到了很好的體現(xiàn)，是第一個(gè)進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗(yàn)的核糖核酸酶。目前，臨床試驗(yàn)中所用的ONC均取自蛙卵和早期胚胎，其存在制備工藝復(fù)雜和獲取困難等問題，難以滿足臨床需要。本實(shí)驗(yàn)室利用人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)的高表達(dá)特性，根據(jù)ONC(AF332139

2、.1)及HSA(NM_000477.5)的基因序列，通過密碼子優(yōu)化及GC含量調(diào)整等方法設(shè)計(jì)并優(yōu)化rONC及其融合蛋白rHSA-ONC的基因序列，并在融合蛋白間插入不同長(zhǎng)度的以Gly4Ser1為模板進(jìn)行重復(fù)的連接肽，得到了高表達(dá)的融合蛋白，簡(jiǎn)稱rHSA-M(0,1,2，3)-ONC。
　　為了研究本實(shí)驗(yàn)室純化的rONC和rHSA-M(0，1,2,3)-ONC對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的rONC和rHSA-M(0,1,2，

3、3)-ONC處理體外培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞RH-35，通過磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法檢測(cè)不同處理組RH-35細(xì)胞的增殖率;Hoechst染色法檢測(cè)不同處理組RH-35細(xì)胞的活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相的分布和凋亡率;qRT-PCR和Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BCL-2、BAX等基因和蛋白的表達(dá)變化;劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rONC和rHSA-M(0,1，2，3)-ONC作用于RH-

4、35細(xì)胞后，細(xì)胞抑制率與藥物處理時(shí)間和濃度呈正相關(guān)（P＜0.05），rONC組細(xì)胞抑制率最高，rHSA-M0-ONC組的細(xì)胞抑制率最低;rONC組使細(xì)胞處于G0/G1期的比例較rHSA-M(0，1,2,3)-ONC組多，rONC組細(xì)胞凋亡率較rHSA-M(0，1，2，3)-ONC組明顯增加，rHSA-M0-ONC組的細(xì)胞凋亡率最低;rONC組和rHSA-M(0，1,2,3)-ONC組均能使BCL-2表達(dá)下調(diào)，BAX表達(dá)上調(diào);rONC組抑

5、制細(xì)胞遷移的能力較rHSA-M(0，1，2，3)-ONC組高。綜上所述，rONC和rHSA-M(0，1，2，3)-ONC均能抑制RH-35細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)其凋亡，但對(duì)增殖的抑制作用和對(duì)凋亡的促進(jìn)作用存在差異。其中rONC的活性最強(qiáng)，rHSA-M(0，1,2，3)-ONC的活性與連接肽長(zhǎng)度有關(guān)，隨著連接肽長(zhǎng)度增加，融合蛋白對(duì)RH-35細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng);rONC和rHSA-M(0，1,2，3)-ONC可通過上調(diào)BAX表達(dá)和下調(diào)B