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文檔簡介
1、研究表明,GADD45α是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的基因,其以低豐度組成型表達(dá),但可通過各種應(yīng)激刺激(包括紫外線和電離輻射)轉(zhuǎn)錄激活,并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,凋亡,維持基因組穩(wěn)定性,DNA甲基化切除/修復(fù)和免疫應(yīng)答等。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)GADD45α在大鼠再生肝的肝細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)。然而,GADD45α對(duì)肝再生的作用和調(diào)控機(jī)制尚未有報(bào)道。為此,本課題擬深入研究GADD45α調(diào)控大鼠肝細(xì)胞BRL-3A以及DNA損傷誘導(dǎo)后的BRL-3A細(xì)胞的分子機(jī)理。
2、r> 為了解GADD45α對(duì)大鼠肝再生的作用及調(diào)控機(jī)理,在基于本實(shí)驗(yàn)室對(duì)再生肝基因表達(dá)譜分析的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),GADD45α在肝再生啟動(dòng)階段(0-2 h)和進(jìn)展階段(6-72 h)各有一個(gè)表達(dá)高峰,推測它可能參與肝切除后肝細(xì)胞的快速增殖,研究表明GADD45α可能與再生肝肝細(xì)胞增殖中的DNA損傷修復(fù)相關(guān)。本文用qRT-PCR驗(yàn)證了芯片檢測結(jié)果的可靠性。用IPA、GenMAPP、KEGG、BIOCARTA、QIAGEN和Biocompare
3、等幾個(gè)數(shù)據(jù)庫以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)構(gòu)建了GADD45α的信號(hào)通路圖并分析其可能的作用機(jī)理,表明GADD45α可能通過P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、P21、AKT和MTOR信號(hào)通路調(diào)控正常BRL-3A細(xì)胞以及FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的增殖、凋亡、周期以及DNA損傷修復(fù)。
本文通過基因過表達(dá)和基因干涉的方法獲得了GADD45α上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的BRL-3A細(xì)胞,對(duì)GADD45α調(diào)節(jié)正常BRL-3A細(xì)胞以及F
4、ZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的增殖、凋亡、周期以及DNA損傷修復(fù)進(jìn)行了初步研究。MTT結(jié)果顯示過表達(dá)GADD45α明顯抑制了BRL-3A細(xì)胞的細(xì)胞活力,增強(qiáng)了FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的活力,而干涉GADD45α的表達(dá)增強(qiáng)了BRL-3A細(xì)胞的細(xì)胞活力,抑制了FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的活力;EdU結(jié)果表明GADD45α過表達(dá)抑制了BRL-3A細(xì)胞增殖,同時(shí)減弱了FZD/UVC對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用,而干涉GADD4
5、5α的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖,同時(shí)增強(qiáng)了FZD/UVC對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)GADD45α過表達(dá)導(dǎo)致正常BRL-3A細(xì)胞G1和S期細(xì)胞數(shù)量減少,G2/M期阻滯,同時(shí)增加了FZD/UVC誘導(dǎo)的S期細(xì)胞周期停滯,而干涉GADD45α的表達(dá)導(dǎo)致正常BRL-3A細(xì)胞G1細(xì)胞數(shù)量減少,G2/M和S期期細(xì)胞數(shù)量增多,同時(shí)減少了FZD/UVC誘導(dǎo)的S期停滯;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明GADD45α過表達(dá)對(duì)正常BRL-3A細(xì)
6、胞凋亡沒有明顯作用,卻抑制了FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的凋亡,干涉GADD45α的表達(dá)抑制了正常BRL-3A細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)了FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞的凋亡;采用qRT-PCR和Western Blot等方法檢測GADD45α表達(dá)變化對(duì)正常BRL-3A細(xì)胞中GADD45α信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)變化的影響,結(jié)果顯示,P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、AKT和MTOR等信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生
7、顯著的變化。檢測FZD/UVC誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞中增殖、凋亡和周期相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)變化的影響,結(jié)果顯示,MYC、BCL-2、CCND1、CCNB1、PCNA、P21、CASPASE3、CASPASE8、CASPASE9和BAX等基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。表明:GADD45α可能通過P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、AKT和MTOR等信號(hào)通路調(diào)控BRL-3A細(xì)胞的增殖,通過MYC、BCL-2、CCND1、CCNB
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