裝載Klotho蛋白的多層復(fù)合納米材料對于糖尿病潰瘍的修復(fù)作用.pdf

1、糖尿病是一種全世界的多發(fā)疾病，據(jù)估計到2035年全世界會有3.8億人患上糖尿病。糖尿病又是一種全身性疾病，由于人體自身的調(diào)節(jié)血糖水平的下降，導(dǎo)致全身處于相對高糖的狀態(tài)。在高糖條件下，細胞會受到不同程度的損傷。細胞損傷導(dǎo)致的后果通常會出現(xiàn)在患者的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及循環(huán)系統(tǒng)等，這些系統(tǒng)的損傷會導(dǎo)致各種各樣的并發(fā)癥。循環(huán)系統(tǒng)的損傷會導(dǎo)致受影響的部位產(chǎn)生缺血缺氧等癥狀。在糖尿病患者當(dāng)中，大約有20％的病人會患上糖尿病足潰瘍。具體而言，糖尿病

2、患者的皮膚，尤其是下肢皮膚供血不足，從而使皮膚處于缺血缺氧的狀態(tài)，雖然皮膚本身有一定的側(cè)枝循環(huán)或交通支能夠緩解這種情況，但是糖尿病作為一種全身性疾病影響的并不是單一的血管或某一區(qū)域。一般來說，治療的目的在于改善受損部位的循環(huán)狀態(tài)，盡量憑借人體的自愈功能來達到康復(fù)。傳統(tǒng)的針對糖尿病足的治療方法主要包括止痛、高壓氧、抗感染、降血糖和改善微循環(huán)，但治療效果難以令人滿意。
　　干細胞治療作為一種新興的治療方式，也越來越被研究人員所重視。骨

3、髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)憑借其強大的幫助組織再生以及無免疫原性的特點被廣泛的應(yīng)用于組織工程。已經(jīng)有文獻證明，BMSCs可以修復(fù)燒傷后以及缺血的皮膚，這提示我們BMSCs有可能對皮膚的損傷，比如糖尿病潰瘍，有修復(fù)作用。但是BMSCs自身太過于脆弱，在由于高糖導(dǎo)致的缺血缺氧的糖尿病潰瘍區(qū)域，BMSCs的存活、旁分泌以及抗凋亡作用都會被抑制。因此，如何提高BMSCs在惡劣條件下的生存率以及保證其功能成為我們的主要需要解決的問題。Kloth

4、o蛋白是由Kuro在1977年發(fā)現(xiàn)的一種與生命周期及代謝相關(guān)的蛋白。Klotho蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的鈣磷代謝，并能夠修復(fù)受損的腎小管上皮細胞。同時Klotho蛋白也能夠在脂肪代謝、血管內(nèi)皮修復(fù)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。以上研究提示我們，Klotho蛋白有可能對細胞有正面保護作用。我們通過細胞實驗如MTT、EDU、transwell、劃痕等一系列實驗探究了Klotho蛋白對于BMSCs和ECs的作用，發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白能夠保護高

5、糖條件下的BMSCS和ECs，促進BMSCs和ECs的增殖遷移，并能夠通過對它們的保護作用來達到促進血管新生，從而達到治療DFU的目的。
　　為了使BMSCs能夠在Klotho蛋白的刺激下直接在潰瘍區(qū)域發(fā)揮其修復(fù)作用，我們選擇了以PLGA、明膠和殼聚糖為主要原材料來制備一種固體載體。我們選擇以電紡PLGA為主要技術(shù)手段，通過制備PLGA納米纖維來為BMSCs提供合適的黏附生長環(huán)境。PLGA納米纖維能夠提供合適于細胞黏附的微環(huán)境，同

6、時它本身也是一種控釋材料。但是在傳統(tǒng)的電紡過程當(dāng)中，不可避免的會利用有毒溶劑和高電壓，這些不利因素會影響需要控釋的蛋白的活性。因此我們結(jié)合殼聚糖微球和明膠薄膜來控釋Klotho蛋白，從而在制備復(fù)合材料的時候，能夠避免這些不利因素對于蛋白質(zhì)的影響，使Klotho蛋白能夠保持活性，從而達到長時間刺激BMSCs的目的。該材料的結(jié)構(gòu)類似于三明治，即是用兩層PLGA薄膜包裹一層內(nèi)含殼聚糖微球的明膠薄膜，最后在PLGA薄膜的表面移植上BMSCs。通

7、過PLGA薄膜表面提供的納米級多孔結(jié)構(gòu)，BMSCs能夠很好地粘附在材料表面，并不斷的接受來自內(nèi)層Klotho蛋白的刺激。相比于一過性的刺激，我們認為這種持續(xù)性的刺激能夠使細胞更好的生存。我們通過電鏡掃描觀察了殼聚糖微球、PLGA薄膜表面、明膠薄膜表面的結(jié)構(gòu)以及粘附PLGA薄膜表面的BMSCs的形態(tài)。證明了BMSCs能夠在我們制作的材料上很好的黏附并顯示出正常的形態(tài)。
　　為了驗證復(fù)合材料在修復(fù)DFU中的作用，我們將該復(fù)合材料應(yīng)用于

8、糖尿病潰瘍的C57小鼠上，在五組小鼠身上驗證了Klotho蛋白和BMSCs對于DFU愈合的效果，分別是對照組，Klotho+BMSCs組，單獨BMSCs組，單獨材料組和單獨Klotho組。從結(jié)果看來，Klotho+BMSCs組取得了最好的愈合效果，其次是單獨Klotho組，而其余三組愈合效果沒有明顯差異。證明了Klotho和BMSCs都能夠幫助糖尿病潰瘍愈合，但是單獨的BMSCs在惡劣環(huán)境下無法生存，從而難以發(fā)揮正常的修復(fù)作用。

9、　　本研究旨在探究Klotho蛋白在高糖條件下對于BMSCs及ECs的影響，并找到一種合適的載體能夠?qū)MSCs種植在上面，同時該材料還具備一定的緩釋功能。并找到一種合適的方式能夠降低蛋白類藥物在電紡的過程中的活性損傷的程度，從而能夠讓BMSCs能夠在糖尿病潰瘍的區(qū)域成功的生存并發(fā)揮對于創(chuàng)口的修復(fù)作用。
　　主要的研究成果如下:
　　1、證明了Klotho蛋白在高糖條件下能夠促進BMSCs和ECS的增殖遷移。
　　2、