IWF刺激小麥懸浮細(xì)胞后NO的變化及其與Ca2+的關(guān)系.pdf

1、本試驗首先采用小麥（Triticum aestivum L.）品種洛夫林10的懸浮細(xì)胞與硝普鈉（SNP，NO 供體）互作來研究外源一氧化氮對小麥懸浮細(xì)胞的影響，并利用該體系建立了以Griess 試劑檢測法聯(lián)合DAF-2DA熒光探針標(biāo)記法檢測NO動態(tài)變化的試驗方法。
　　 試驗結(jié)果表明：一氧化氮供體SNP能夠誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞死亡，且在一定濃度下（2.5mmol/L）刺激時，細(xì)胞表現(xiàn)出核染色質(zhì)凝聚、邊緣化等程序性死亡的形態(tài)特征。初步

2、證明外源一氧化氮能夠誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞死亡，并且具有程序性死亡的核形態(tài)變化特征。
　　 在此基礎(chǔ)上以小麥懸浮細(xì)胞與感染葉銹菌（Puccinia triticina）生理小種260的小麥葉片細(xì)胞間隙液（IWF-260）組成互作體系，課題組已經(jīng)證明IWF-260具有激發(fā)子活性。
　　 以Griess 試劑檢測法聯(lián)合DAF-2DA 熒光探針標(biāo)記法檢測NO的產(chǎn)生及變化。結(jié)果顯示：
　　 未接種的小麥細(xì)胞間隙液（IWF-CK

3、）和IWF-260 都能誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞產(chǎn)生NO，并在30min 時有一個NO 峰，但隨著時間的延長NO 產(chǎn)生量逐漸下降，由IWF-260 誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO 比IWF-CK 誘導(dǎo)的要多，熒光探針標(biāo)記結(jié)果更直觀地觀察到了這一現(xiàn)象。當(dāng)使用NO的專一性清除劑cPTIO 處理時，可以顯著的抑制激發(fā)子誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生的NO量。
　　 然后，我們利用改良苯酚品紅染色法，對IWF-CK和IWF-260 處理小麥懸浮細(xì)胞后不同時間進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

4、結(jié)果顯示：IWF-CK 處理后細(xì)胞核形態(tài)沒有明顯的變化，但是，IWF-260 處理以后12h 就出現(xiàn)染色質(zhì)凝集現(xiàn)象，處理24h 核凝集更加明顯，并有顆粒狀物體散布在核內(nèi)，處理后48h大多數(shù)細(xì)胞核染色質(zhì)凝集現(xiàn)象明顯，到72h 核染色質(zhì)趨于邊緣化。以上結(jié)果表明，經(jīng)過激發(fā)子（IWF-260）處理后的小麥懸浮細(xì)胞表現(xiàn)出核染色質(zhì)凝聚和邊緣化等典型的細(xì)胞程序性死亡的形態(tài)特征，初步證明激發(fā)子刺激誘發(fā)產(chǎn)生的NO 可能參與了小麥懸浮細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。<

5、br>　　 我們利用藥物學(xué)試驗對該體系中NO的功能和來源進(jìn)行了初步探討。選用NO的清除劑cPTIO；NOS的抑制劑L-NAME；NR的抑制劑Na2WO4；胞外Ca2+螯合劑EGTA、Ca2+通道阻斷劑LaCl3、Ca2+載體A23187、胞內(nèi)Ca2+通道阻斷劑Heparin以及胞內(nèi)Ca2+庫激活劑Caffeine 預(yù)處理小麥懸浮細(xì)胞，然后再加入IWF-260 處理，并以IWF-CK 處理作為對照，觀察上述藥物對IWF-260 刺激誘發(fā)

6、的NO的產(chǎn)生以及對細(xì)胞死亡的影響。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1.cPTIO 預(yù)處理小麥懸浮細(xì)胞后，再用IWF-CK和IWF-260 處理，我們發(fā)現(xiàn)cPTIO能夠顯著的抑制小麥懸浮細(xì)胞死亡，表明在該體系中NO 介導(dǎo)了激發(fā)子刺激誘發(fā)的小麥細(xì)胞死亡過程。
　　 2.L-NAME和Na2WO4 預(yù)處理小麥懸浮細(xì)胞后，再用IWF-CK和IWF-260 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Na2WO4 預(yù)處理后能顯著的降低NO的產(chǎn)生以及細(xì)胞死

7、亡率，而L-NAME的抑制作用要弱于Na2WO4，并且熒光探針標(biāo)記結(jié)果與此相似，說明NR 在小麥懸浮細(xì)胞受IWF-260 刺激誘發(fā)的NO的產(chǎn)生過程中較NOS 起到更重要作用。
　　 3.Ca2+螯合劑EGTA、Ca2+通道阻斷劑LaCl3 預(yù)處理小麥懸浮細(xì)胞，再用IWF-CK和IWF-260 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGTA和LaCl3 都能夠抑制NO的產(chǎn)生以及細(xì)胞死亡率。并且發(fā)現(xiàn)螯合劑EGTA的效果較阻斷劑LaCl3 明顯。此外，用Ca

8、2+載體A23187 處理小麥懸浮細(xì)胞后可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但是明顯低于IWF-260 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率。單獨(dú)使用A23187 處理細(xì)胞也能夠誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞產(chǎn)生NO，但是NO的產(chǎn)生量非常低。此結(jié)果表明，胞外Ca2+內(nèi)流對激發(fā)子誘發(fā)小麥懸浮細(xì)胞產(chǎn)生NO 有一定調(diào)控作用。
　　 4.胞內(nèi)Ca2+通道阻斷劑Heparin、胞內(nèi)Ca2+庫激活劑Caffeine 預(yù)處理小麥懸浮細(xì)胞，再用IWF-CK和IWF-260 處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用Caf

9、feine 預(yù)處理后，細(xì)胞死亡率隨著Caffeine濃度增加而有所增加。而用Heparin 預(yù)處理后，Heparin 對細(xì)胞死亡的影響呈濃度依賴型。據(jù)此提出，胞內(nèi)Ca2+可能參與了小麥懸浮細(xì)胞抵抗激發(fā)子刺激過程中鈣信號的形成，這一過程主要通過IP3 途徑完成。
　　 綜上所述，外源NO能夠誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞發(fā)生死亡，并且具有程序性死亡的特征；
　　 而感染葉銹菌的細(xì)胞間隙液也能誘發(fā)小麥懸浮細(xì)胞NO的迸發(fā)，并且也導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生