IWF刺激小麥懸浮細(xì)胞后H2O2的變化及其與Ca2+的關(guān)系.pdf

1、本試驗以小麥（Triticum aestivum L.）品種洛夫林10 與葉銹菌（Puccinia triticina）生理小種260組成不親和組合的小麥細(xì)胞間洗脫液IWF(Intercellular washing fluids）-260做為激發(fā)子刺激小麥洛夫林10 懸浮細(xì)胞，以化學(xué)發(fā)光法檢測活性氧的變化情況，并借助熒光探針DCFHDA 標(biāo)記H2O2 來觀察IWF-260 刺激后小麥懸浮細(xì)胞的活性氧迸發(fā)現(xiàn)象。以未接種葉片提取的IWF-

2、CK 作為對照。結(jié)果如下：IWF-CK 只引起活性氧含量的緩慢上升，并很快消失。而IWF-260 刺激懸浮細(xì)胞后1 h 內(nèi)會產(chǎn)生明顯的活性氧爆發(fā),30 min 時達(dá)到峰值約為0.1 μmol/L，并且此時熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。
　　 我們利用藥物學(xué)試驗，在IWF-260 處理前分別加入抗氧化藥物過氧化氫酶（CAT)；NADpH氧化酶抑制劑DPI、咪唑(Imidazole)；Ca2+螯合劑EGTA、Ca2+通道阻斷劑LaCl3；IWF

3、-260 處理同時加入Ca2+載體A23187以及只單獨(dú)加入Ca2+載體A23187 刺激懸浮細(xì)胞。觀察上述藥物對IWF-260 誘導(dǎo)的H2O2 產(chǎn)生以及細(xì)胞死亡情況的影響。主要試驗結(jié)果如下：
　　 1.預(yù)加入抗氧化藥物CAT后再加入IWF-260，H2O2 爆發(fā)強(qiáng)度降低,30 min 時約比單獨(dú)IWF-260 刺激引起的H2O2 爆發(fā)量低約20 ％；懸浮細(xì)胞死亡數(shù)量也比單獨(dú)IWF-260刺激引起的細(xì)胞死亡降低了50 ％之多。此

4、結(jié)果表明，小麥懸浮細(xì)胞與IWF-260 互作過程中產(chǎn)生的H2O2 可能與懸浮細(xì)胞的死亡有關(guān)。
　　 2.預(yù)加入NADpH氧化酶抑制劑DPI 或咪唑后再加入IWF-260，在30 min 時H2O2產(chǎn)生量與單獨(dú)IWF-260 刺激引起的H2O2 爆發(fā)量分別降低了約20 ％和10 ％，相應(yīng)的細(xì)胞死亡率也明顯降低。此結(jié)果表明，質(zhì)膜NADpH氧化酶在IWF-260 誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞產(chǎn)生H2O2的過程中發(fā)揮重要作用。另外，我們利用熒光探針

5、HE(Hydroethidine)對懸浮細(xì)胞的進(jìn)行染色，通過顏色變化間接的反映質(zhì)膜NADpH氧化酶的活性高低。結(jié)果表明IWF-260 刺激懸浮細(xì)胞10 min 時就有NADpH氧化酶活性的活化。說明質(zhì)膜NADPH氧化酶的活化在H2O2 產(chǎn)生之前。
　　 3.預(yù)加入Ca2+螯合劑EGTA、Ca2+通道阻斷劑LaCl3后再加入IWF260,30 min 時EGTA和LaCl3 處理約分別降低H2O2的產(chǎn)生量30 ％和20 ％左右，懸

6、浮細(xì)胞死亡率明顯下降。A23187 可以明顯增加IWF-260 誘導(dǎo)的H2O2 產(chǎn)生以及細(xì)胞死亡。只加入Ca2+載體A23187 時表現(xiàn)為長時間內(nèi)持續(xù)大量的活性氧產(chǎn)生。此結(jié)果表明，胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流對IWF-260 誘導(dǎo)的H2O2的產(chǎn)生有一定調(diào)節(jié)作用，并且A23187的作用方式與IWF-260 明顯不同。
　　 4.一定濃度的外源H2O2 可以誘導(dǎo)小麥懸浮細(xì)胞程序性死亡。
　　 綜上所述，IWF-260可以引起懸浮細(xì)胞H2