NaCl及其聯(lián)合Ca2+處理下發(fā)芽大豆生理變化與GABA富集調(diào)控機理.pdf

1、大豆（Glycine max L.）富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。大豆籽粒發(fā)芽期間，內(nèi)源酶系統(tǒng)被激活，蛋白質(zhì)等貯藏性物質(zhì)分解生成易于吸收利用的小分子物質(zhì)，抗營養(yǎng)因子減少，尤其具有多種生理作用的γ-氨基丁酸(GABA)等功能性物質(zhì)得以富集。高等植物中GABA主要由GABA支路和多胺降解途徑合成，其中谷氨酸脫羧酶(GAD，EC4.1.1.15)、二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)、多胺氧化酶(PAO，EC1.5.3

2、.3)和氨基醛脫氫酶（AMADH, EC1.2.1.19）是這兩條途徑中合成GABA的關(guān)鍵酶。植物在逆境脅迫條件下GABA合成酶激活，GABA大量積累。Ca2+對緩解植物非生物脅迫以及GABA的積累起重要作用。本文研究從生理代謝水平、酶水平、基因水平和蛋白質(zhì)水平探討NaCl及其聯(lián)合Ca2+調(diào)控發(fā)芽大豆GABA富集機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、研究了NaCl脅迫對發(fā)芽大豆生理代謝和GABA富集的影響。NaCl脅迫下，發(fā)芽大豆生長

3、受到抑制，芽長、呼吸速率、干物質(zhì)含量以及單株發(fā)芽大豆與其子葉和胚的干、鮮重均顯著下降;子葉和胚中丙二醛和H2O2含量顯著增加;可溶性蛋白含量增加而游離氨基酸含量降低;超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力無顯著變化(p＞0.05)，胚中過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活力均顯著提高;NaCl脅迫顯著影響大豆可溶性糖和脯氨酸含量;NaCl脅迫下，發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD、DAO、PAO和AMADH活力均顯著提

4、高，且胚中GAD和DAO活力顯著高于子葉(p＜0.05)，發(fā)芽4d時子葉和胚中GABA含量分別是對照（未脅迫處理）的1.54倍和1.70倍，谷氨酸(Glu)和游離態(tài)多胺(fPAs)含量受NaCl脅迫調(diào)節(jié)。NaCl脅迫基礎(chǔ)上施用氨基胍（AG，胺氧化酶抑制劑）顯著降低了各部位PAO和AMADH活力(p＜0.05)，DAO活力則完全被抑制，GAD活力無顯著變化(p＞0.05)，多胺降解途徑被抑制，子葉和胚中GABA含量分別下降31.5％和33

5、.5％;子葉中Glu和fPAs含量均顯著增加，胚中Glu含量顯著降低而fPAs含量顯著增加。NaCl脅迫下多胺降解途徑對大豆發(fā)芽富集GABA的貢獻率大于30％。
　　2、研究了NaCl脅迫下Ca2+對發(fā)芽大豆生理代謝和GABA富集的影響。NaCl脅迫下，發(fā)芽大豆經(jīng)CaCl2處理，SOD、CAT、POD和GPX活力顯著增加(p＜0.05)，緩解NaCl脅迫對發(fā)芽大豆生長的抑制，其芽長、呼吸速率、干物質(zhì)含量以及單株發(fā)芽大豆與其子葉和胚

6、的干、鮮重均顯著增加，丙二醛以及H2O2含量顯著降低(p＜0.05)，而施用LaCl3（Ca2+通道抑制劑）則呈相反的變化趨勢;CaCl2或LaCl3處理后發(fā)芽大豆中可溶性糖含量均顯著降低，胚中脯氨酸含量亦顯著降低;NaCl聯(lián)合CaCl2處理下，發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD顯著增加，分別是單獨NaCl處理中的1.45倍和1.74倍，而各部位DAO、PAO和AMADH活力均顯著降低，單株大豆子葉和胚中GABA含量分別為NaCl脅迫處理1.12

7、倍和2.14倍;LaCl2處理顯著降低發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD、DAO、PAO和AMADH活力，GABA含量顯著降低;CaCl2或LaCl3處理均顯著增加子葉和胚中fPAs含量，降低子葉中Glu含量;在NaCl聯(lián)合CaCl2或LaCl3基礎(chǔ)上施用AG，發(fā)芽大豆子葉中GABA含量分別降低17.0％和20.5％，而胚中分別下降11.7％和7.8％。NaCl聯(lián)合CaCl2處理可緩解NaCl脅迫對發(fā)芽大豆生長的抑制，提高生物量和單株大豆GABA

8、含量，同時GABA支路關(guān)鍵酶活力顯著提高，抑制多胺降解途徑中關(guān)鍵酶活力則顯著下降，從而多胺降解途徑對GABA富集貢獻率下降;NaCl聯(lián)合LaCl3處理抑制Ca2+對抗氧化酶所起的調(diào)控作用，發(fā)芽大豆生長停滯并阻礙GABA累積。
　　3、采用RACE(Rapid-amplification ofcDNA ends)技術(shù)，設(shè)計兼并引物、3'和5'端特異性引物，克隆發(fā)芽大豆AMADH基因。將中間片段、上游及下游cDNA序列拼接得到1679

9、 bp的AMADH基因序列（包含部分內(nèi)含子）。運用DNAStar和BioXM在線軟件分析序列，發(fā)現(xiàn)AMADH基因序列包含有1515 bp開放閱讀框，編碼505個氨基酸的多肽序列（GenBank登錄號:KC478661），預測分子量為54.79 kDa，等電點pI為5.16。
　　4、研究NaCl及其聯(lián)合Ca2+對發(fā)芽大豆GABA合成酶基因表達的影響。NaCl脅迫下，發(fā)芽大豆子葉和胚中GAD、DAO和AMADH表達量均顯著上調(diào)(p＜

10、0.05);NaCl脅迫基礎(chǔ)上施用AG，各部位GAD表達量均無顯著變化(p＞0.05)，子葉中DAO和AMADH表達量顯著下調(diào)(p＜0.05)，而胚中無顯著變化; NaCl聯(lián)合CaCl2處理，發(fā)芽大豆子葉中GAD表達量無顯著變化(p＞0.05)，DAO和AMADH表達量顯著下降，胚中GAD、DAO和AMADH表達量均顯著下降(p＜0.05);NaCl聯(lián)合LaCl3處理抑制GAD和DAO的表達水平;在此基礎(chǔ)上抑制多胺降解途徑，發(fā)芽大豆各部

11、位GAD、DAO和AMADH表達量較單獨NaCl脅迫無顯著變化(p＞0.05)。NaCl脅迫提高GABA合成酶活力及其基因表達水平，積累GABA; CaCl2處理下，GAD活力的提高由Ca2+刺激所致，與其基因表達無關(guān)，CaCl2顯著抑制多胺降解途徑代謝酶活力及其基因表達，降低其對GABA貢獻率;NaCl聯(lián)合LaCl3處理抑制GAD和DAO酶活力及其基因表達量，阻礙GABA積累;AG對GABA合成酶基因表達無顯著影響。
　　5、研

12、究NaCl脅迫下發(fā)芽大豆蛋白質(zhì)組差異表達。NaCl及其聯(lián)合AG處理下，從發(fā)芽大豆子葉和胚中分別成功鑒定出具統(tǒng)計學意義且豐度變化大于1.5倍或小于0.67倍的72個和63個差異表達蛋白。子葉中差異蛋白有62.5％是貯藏蛋白，其余差異蛋白涉及代謝、能量、細胞生長與分裂、蛋白水解、轉(zhuǎn)運以及防御功能，主要定位于細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、線粒體以及液泡;胚中差異蛋白涉及9個功能分類，包括細胞代謝、能量、細胞生長與分裂、蛋白質(zhì)合成、蛋白定向與貯藏、蛋

13、白轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導、防御以及次級代謝，分布于細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、線粒體、液泡、細胞質(zhì)骨架以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。NaCl脅迫下，發(fā)芽大豆Glu和PAs代謝途徑中的蛋白豐度具有顯著性變化，其中，NaCl處理顯著降低谷氨酰胺合成酶PR-2以及谷氨酰胺合成酶前體的蛋白豐度，而顯著提高甲硫氨酸合成酶和5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶豐度，AMADH豐度在NaCl脅迫下同樣顯著高于對照，從而有利于發(fā)芽大豆體內(nèi)GABA的富集。
　　6、研究

14、NaCl聯(lián)合Ca2+處理下發(fā)芽大豆蛋白質(zhì)組差異表達。NaCl聯(lián)合CaCl2或LaCl3處理后共在發(fā)芽大豆子葉和胚中成功鑒定出具統(tǒng)計學意義且豐度變化大于1.5倍或小于0.67倍的80和71個差異表達蛋白。鑒定出的差異蛋白主要涉及細胞代謝、能量、細胞生長與分裂、蛋白質(zhì)合成、蛋白定向與貯藏、蛋白轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導、防御以及次級代謝等功能，且分布于細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、線粒體、液泡、細胞質(zhì)骨架以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。CaCl2處理下，發(fā)芽大豆通過加速信號轉(zhuǎn)導

15、、能量代謝以及蛋白轉(zhuǎn)運、促進蛋白合成并抑制蛋白降解、重新動員分配貯藏蛋白、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、強化抗氧化酶系統(tǒng)、富集次級代謝產(chǎn)物以及其它未知的適應(yīng)性生理調(diào)節(jié)增強其對于NaCl脅迫的耐受性。NaCl聯(lián)合CaCl2處理下，發(fā)芽大豆中參與Glu代謝的谷氨酰胺合成酶PR-2以及谷氨酰胺合成酶前體的豐度均顯著下降;而LaCl3處理后谷氨酰胺合成酶PR-2未檢出，谷氨酰胺合成酶前體的豐度顯著增加;參與PAs代謝的兩個S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及甲