發(fā)芽蠶豆富集GABA的關(guān)鍵酶特性與低氧及其聯(lián)合NaCl脅迫的調(diào)控機(jī)理.pdf

1、蠶豆（ViciafabaL.）籽粒富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。在發(fā)芽過程中，蠶豆籽粒內(nèi)源酶系統(tǒng)被激活，蛋白質(zhì)、碳水化合物等貯藏性物質(zhì)被分解成易于吸收利用的小分子物質(zhì)，對(duì)人體具有生理作用的γ-氨基丁酸(GABA)等功能性物質(zhì)生成或得以富集，同時(shí)抗?fàn)I養(yǎng)因子降解。植物中GABA由GABA支路和多胺降解途徑合成，其中谷氨酸脫羧酶(GAD，EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)分別是這兩條途徑中合成

2、GABA的限速酶。發(fā)芽蠶豆在低氧脅迫下激活GAD和DAO，GABA大量積累。Ca2+和脫落酸(ABA)對(duì)植物逆境信號(hào)的傳遞起重要作用。本文研究了發(fā)芽蠶豆中GAD和DAO酶學(xué)特性，揭示了低氧及其聯(lián)合NaCl脅迫下Ca2+和ABA對(duì)GABA富集的影響機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、研究了蠶豆發(fā)芽過程中GAD及DAO的變化情況以及純化后的酶學(xué)特性。在5d的發(fā)芽過程中，GAD活力在胚根中上升較快，且活力最高;DAO活力在胚芽中急劇上升。

3、30℃和酸性條件下發(fā)芽更利于提高GAD和DAO活力;氨氧乙酸和氨基胍(AG)分別顯著抑制GAD和DAO活力，其抑制率隨濃度的增加而提高;6.0mmol/LCaCl2均可提高發(fā)芽蠶豆中GAD和DAO活力，而0.5mmol/LEDTA-Na2顯著抑制GAD和DAO活力,GAD和DAO可分別被90mmol/L的PLP和CuCl2激活。發(fā)芽5d的蠶豆中GAD和DAO經(jīng)純化后，SDS-PAGE電泳測(cè)得其亞基分子量分別為58kDa及52kDa。兩者

4、最適反應(yīng)溫度均為40℃，最適反應(yīng)pH分別為6.0和6.5。GAD活力被Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、氨氧乙酸、EGTA、EDTA-Na2、L-半胱氨酸(L-cys)和β-巰基乙醇顯著抑制，而被低濃度Ca2+(0.2mmol/L)激活;DAO活力被Mg2+、Cu2+和Fe3+、AG、EGTA、EDTA-Na2、L-cys和β-巰基乙醇抑制。GAD對(duì)Glu的Km為2.63mmol/L;DAO對(duì)腐胺(Put)和亞精胺(Spd)的Km

5、分別為0.23mmol/L和0.96mmol/L，而對(duì)Spm無降解作用。
　　2、研究了蠶豆發(fā)芽3d和5d時(shí)GABA富集情形。非脅迫發(fā)芽時(shí)，隨發(fā)芽時(shí)間的延長，蠶豆中GABA含量及DAO無顯著變化，GAD活力在發(fā)芽5d時(shí)顯著提高(P＜0.05)，Glu及PAs含量呈上升趨勢(shì)。低氧脅迫提高了發(fā)芽蠶豆GAD和DAO活力，Glu和PAs與GABA含量顯著提高(P＜0.05)。當(dāng)發(fā)芽5d時(shí)，GABA含量提高了3.27倍，其中子葉和胚中分別提

6、高了1.10及17.14倍。解除低氧脅迫促使GAD活力顯著升高和DAO活力顯著下降，同時(shí)GABA、Glu及PAs含量顯著降低(P＜0.05)。低氧脅迫下用AG處理后，DAO活力被抑制，阻止PAs向GABA轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致PAs積累。當(dāng)處理3d和5d時(shí)，GABA分別減少了30.30％和30.80％。
　　3、低氧處理和NaCl脅迫對(duì)發(fā)芽蠶豆GABA的富集具有疊加作用，且達(dá)到最高含量的脅迫時(shí)間縮短;解除NaCl、低氧處理3d后，GABA含量

7、高于低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理者。低氧聯(lián)合NaCl脅迫下加入AG后，發(fā)芽3d的蠶豆中GABA含量減少了29.82％。低氧聯(lián)合NaCl處理強(qiáng)烈抑制GAD活力，且抑制DAO活力的時(shí)間滯后。解除脅迫后蠶豆子葉中GAD與DAO活力顯著提高。低氧條件下加入NaCl增強(qiáng)了脅迫強(qiáng)度，增加的GABA主要是多胺降解途徑貢獻(xiàn)的。解除脅迫后PAs積累。
　　4、研究了Ca2+對(duì)低氧聯(lián)合NaCl脅迫下蠶豆發(fā)芽富集GABA的調(diào)節(jié)作用。6.0mmol/LCaC

8、l2使發(fā)芽蠶豆子葉、胚芽及胚根中GABA含量分別提高了14.68％、19.30％和8.51％，EDTA顯著降低GAD與DAO活力，導(dǎo)致GABA富集量的降低(P＜0.05)。Ca2+顯著激活胚芽中GAD，對(duì)子葉和胚根則無顯著影響(P＞0.05);在Ca2+處理基礎(chǔ)上加入AG，使子葉和胚根中GAD活力增加，胚芽中GAD活力則下降，而各部位DAO活力下降，其中胚芽DAO活力被抑制(P＜0.05)。低氧聯(lián)合NaCl脅迫下CaCl2處理后，胚根中

9、Glu含量提高幅度最大，子葉次之，胚芽最小。EDTA處理顯著降低子葉和胚芽中Glu含量，胚根中則顯著升高(P＜0.05)。6.0mmol/L的CaCl2顯著提高Put含量，EDTA加入后抑制了DAO活力，從而促進(jìn)Put累積。
　　5、研究了低氧聯(lián)合NaCl脅迫下ABA對(duì)發(fā)芽蠶豆富集GABA的調(diào)節(jié)作用。ABA處理促使GAD和DAO活力升高（P＜0.05），同時(shí)GABA和Glu的累積具有顯著作用(P＜0.05)。在ABA處理基礎(chǔ)上加入

10、AG后，子葉和胚芽中Glu分別降低了35.15％和29.85％;ABA處理后，發(fā)芽蠶豆子葉、胚芽以及胚根中Put含量分別提高83.92％、125.79％和100.76％;在ABA處理基礎(chǔ)上添加AG后，子葉和胚根中Put含量繼續(xù)升高。ABA可顯著提高Spd和Spm的累積量。氟草酮(Flu)處理顯著降低子葉和胚芽GAD活力以及子葉DAO活力，胚芽和胚根中GABA含量分別降低21.07％和28.88％;在Flu處理基礎(chǔ)上添加AG后，發(fā)芽蠶豆胚

11、芽和胚根中DAO活力分別降低26.58％和11.26％，對(duì)發(fā)芽蠶豆中Glu含量無顯著影響(P＞0.05);Flu導(dǎo)致Put和Spm累積，Spd含量則顯著下降。
　　6、采用RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)技術(shù)，設(shè)計(jì)兼并引物、3'和5'端特異性引物，克隆發(fā)芽蠶豆GAD和DAO基因。將中間片段、上游及下游cDNA序列拼接，分別得到1787bp和2199bp的GAD與DAO基因序列（包含部分內(nèi)含子）

12、。運(yùn)用DNAStar和BioXM在線軟件分析上述序列，發(fā)現(xiàn)GAD基因序列包含有1527bp開放閱讀框，可編碼509個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):JX444699);DAO基因包含有2025bp開放閱讀框，可編碼675個(gè)氨基酸（GenBank登錄號(hào):JX444698）。
　　7、研究了低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理下GABA富集與GAD和DAO基因表達(dá)的關(guān)系。低氧或低氧聯(lián)合NaCl處理均顯著提高發(fā)芽蠶豆GAD和DAO活力，促進(jìn)GABA的

13、富集。NaCl處理后發(fā)芽蠶豆子葉中GABA的富集效果最好。低氧和低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理均促進(jìn)發(fā)芽蠶豆胚根中GAD基因的表達(dá)。在低氧脅迫下，發(fā)芽蠶豆各部位中DAO基因表達(dá)水平反而下調(diào)，低氧下AG處理和低氧聯(lián)合NaCl脅迫處理對(duì)子葉和胚芽中GAD基因表達(dá)有顯著促進(jìn)作用;當(dāng)采用低氧聯(lián)合NaCl脅迫時(shí)，發(fā)芽蠶豆子葉和胚芽中DAO基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　8、低氧聯(lián)合NaCl脅迫下外源CaCl2顯著提高了發(fā)芽蠶豆胚芽中GAD和DAO活力

14、，子葉和胚芽中GABA含量顯著提高(P＜0.05)。EDTA處理降低了發(fā)芽蠶豆各部位GAD和DAO活力，并顯著降低子葉和胚根中GABA含量。CaCl2處理顯著提高發(fā)芽蠶豆子葉中GAD基因表達(dá)量，卻顯著降低胚根中的表達(dá)量(P＜0.05)，對(duì)胚芽中的表達(dá)量無顯著影響。與GAD不同，CaCl2處理顯著提高發(fā)芽蠶豆胚芽中DAO基因的表達(dá)量，對(duì)子葉中的表達(dá)量無顯著影響，卻顯著降低了胚根中的表達(dá)量。EDTA處理顯著降低發(fā)芽蠶豆子葉中GAD基因表達(dá)量

15、，而顯著提高胚芽中其表達(dá)量，對(duì)胚根中無顯著影響，但是促進(jìn)了發(fā)芽蠶豆各部位中DAO基因的表達(dá)。
　　9、低氧聯(lián)合NaCl脅迫下ABA處理使發(fā)芽蠶豆GAD和DAO活力顯著升高，同時(shí)GABA含量顯著增加;ABA處理顯著降低發(fā)芽蠶豆子葉和胚根中GAD基因表達(dá)量，但使胚芽中其表達(dá)量提高。與GAD基因表達(dá)情形不同，ABA處理使發(fā)芽蠶豆各部位的DAO基因表達(dá)量上升。當(dāng)采用ABA合成抑制劑Flu處理發(fā)芽蠶豆時(shí)，GAD和DAO活力被不同程度地抑制，