水稻APX與CAT同工酶的功能特性及其與鹽脅迫關(guān)系的研究.pdf

1、水稻是全球性重要的糧食作物，由于環(huán)境脅迫造成的產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降的損失是驚人的。鹽堿等環(huán)境脅迫條件下，植物體由于細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生增多，引發(fā)了活性氧的代謝紊亂，對細(xì)胞造成了一系列的毒害。如何有效地清除過多的活性氧，調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡，增強(qiáng)抗氧化酶活性與提高抗氧化代謝水平，最大限度地降低活性氧的毒害作用，已成為當(dāng)今植物抗性機(jī)理研究的一個熱點(diǎn)。在本研究中，我們選取了水稻抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵解毒酶抗壞血酸過氧化物酶(ascorbatepe

2、roxidase，APX)與過氧化氫酶(catalase，CAT)同工酶，在碳酸鹽等脅迫下，對同工酶基因的表達(dá)特性、植物體內(nèi)同工酶的功能特性與鹽脅迫的關(guān)系進(jìn)行了比較研究；同時，對同工酶基因的重組蛋白在體外的表達(dá)特性，以及轉(zhuǎn)基因植物突變體及其相關(guān)生理生化代謝，進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。以期對脅迫下的植物抗性機(jī)理進(jìn)行補(bǔ)充與探索，為提高植物抗逆性的研究提供理論依據(jù)。主要獲得了以下研究結(jié)果： 根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫及水稻基因組序列信息，利用R

3、T-PCR方法，獲得了水稻APX同工酶基因APXa、APXb與CAT同工酶基因CAT1、CAT2的功能區(qū)片段。兩個APX同工酶基因推定的氨基酸序列的相似性為92％，預(yù)測定位于微體過氧化物體的可能性分別為47.4％和50.8％；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性都為45％。CAT同工酶基因推定的氨基酸序列的相似性分別為76.4％，預(yù)測定位于微體過氧化物體的可能性分別為74.8％、64％；定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為45％。在80mMNaCl，30mMNaHC

4、O3，15mMNa2CO3，10％PEG,15mMH2O2等脅迫條件下，基因表達(dá)結(jié)果顯示：APX同工酶基因在葉與根中均可表達(dá)，表達(dá)上既有相似趨勢又有細(xì)微差異：與對照相比，APXa、APXb在葉中以80mMNaCl處理表達(dá)量最高；APXb在根中的30mMNaHCO3，15mMNa2CO3處理時表達(dá)量高于80mMNaCl的處理，以15mMH2O2的表達(dá)量最高，均強(qiáng)于對照水平，此特點(diǎn)與APXa存在不同；APX同工酶基因受到脅迫時表現(xiàn)出各自的特

5、性。CAT同工酶基因受到脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)量顯著增加，在葉中的表達(dá)均高于根；CAT1與CAT2存在較細(xì)微的表達(dá)差異：CAT1在葉中以15mMH2O2的表達(dá)量最高，在根中的各處理中表達(dá)量相似；CAT2在根與葉中，均表現(xiàn)以80mMNaCl、15mMNa2CO3和15mMH2O2處理的表達(dá)量較高。 結(jié)合同工酶基因的差異表達(dá)特性，我們在活性蛋白質(zhì)水平上對水稻體內(nèi)APX、CAT同工酶的表達(dá)特性與上述鹽脅迫的關(guān)系進(jìn)行了研究。酶活性結(jié)果顯示，AP

6、X總活性由于鹽脅迫而緩慢升高，CAT活性受脅迫呈波動變化趨勢，酶活性在葉片與根中存在差異。APX、CAT同工酶的酶譜分析進(jìn)一步揭示了酶活性與上述鹽脅迫的關(guān)系，至少有五種APX同工酶被檢測到，并且有新譜帶在處理的48hr后樣本中出現(xiàn)；三種CAT同工酶譜帶被檢測到；葉片中的酶譜種類多于根中；脅迫處理下，水稻組織中的H2O2含量表現(xiàn)波動的變化趨勢；抗壞血酸含量表現(xiàn)出增加的趨勢，與酶活性呈正相關(guān)。本研究結(jié)果，顯示出水稻APX與CAT同工酶在脅迫

7、脅迫下的差異表達(dá)特征。 為進(jìn)一步闡明水稻APXa與APXb同工酶的酶學(xué)特性，采用蛋白質(zhì)重組技術(shù)，將水稻APX同工酶APXa、APXb基因和CAT同工酶CAT1、CAT2基因分別重組入原核表達(dá)載體pGEX-6p-3中，繼而轉(zhuǎn)入E.coli菌株BL21中進(jìn)行體外表達(dá)GST融合蛋白。研究結(jié)果表明，在適宜的誘導(dǎo)條件下，重組蛋白獲得了大量的表達(dá)；通過純化程序的優(yōu)化，獲得了高純度、高活性、高得率的融合蛋白，每克細(xì)胞(干重)中分別純化出51m

8、gGST-APXa和77mgGST-APXb。酶動力學(xué)分析結(jié)果表明，GST-APXa和GST-APXb的比活性分別為15and20mMascorbate.min-1.mg-1protein，對ascorbate的米氏常數(shù)分別為4和1mM，對H2O2的米氏常數(shù)分別為0.3和0.7mM。GST-APX融合蛋白經(jīng)蛋白酶水解，獲得了天然活性的蛋白APXa和APXb。水稻APX同工酶表現(xiàn)出差異的酶學(xué)特性；GST-CAT融合蛋白在E.coli中得到

9、了正常的誘導(dǎo)表達(dá)。 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，分別將水稻APXa、APXb、CAT1、CAT2基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草的再生植株，轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定結(jié)果證明，外源基因整合入受體煙草基因組中，轉(zhuǎn)基因再生植株經(jīng)過精心培育，開花結(jié)實(shí)并獲得了自交種子。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株在遺傳表達(dá)、生理生化代謝及抗鹽表現(xiàn)進(jìn)行了較全面的分析。mRNA表達(dá)結(jié)果表明，水稻APXb、APXa基因分別在轉(zhuǎn)基因煙草株系A(chǔ)PXb-1、APXb-3、APX

10、b-6、APXa-8、APXa-14、APXa-25的葉片中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)；轉(zhuǎn)基因煙草株系CAT1-6、CAT1-16、CAT1-17、CAT2-3、CAT2-11、CAT2-14分別進(jìn)行了正常的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵萑~片中未見轉(zhuǎn)錄表達(dá)。外源水稻基因的不同轉(zhuǎn)錄表達(dá)，將改變受體煙草植株的APX、CAT活性及相關(guān)的細(xì)胞生理代謝。 CAT同工酶活性電泳分析，轉(zhuǎn)基因株系CAT1-17、CAT2-11分別檢測到特異的同工酶譜帶；酶活性