蛋白質(zhì)組學(xué)解析TLR2的天然免疫應(yīng)答和TNF-α刺激的14-3-3蛋白復(fù)合物的研究.pdf

1、本論文主要以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的定量技術(shù)平臺(tái)，詳細(xì)研究了特異性激動(dòng)劑引起的巨噬細(xì)胞TLR2的天然免疫應(yīng)答和腫瘤壞死因子刺激下14-3-3 epsilon蛋白復(fù)合物的組成變化情況；同時(shí)與傳統(tǒng)的酶解方法不同，本文也嘗試了用微流控芯片技術(shù)來固定蛋白酶，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜的實(shí)際樣品的快速、高效酶解，并與傳統(tǒng)的酶解方法進(jìn)行了比較。
　　 論文的第一章綜述了近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)在方法上、技術(shù)上及應(yīng)用方面的研究

2、進(jìn)展以及蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)在生物學(xué)上的進(jìn)展，特別強(qiáng)調(diào)了目前應(yīng)用比較廣泛的氨基酸同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)；指出了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用，并由此引出了本論文的研究背景；文中最后闡述了本論文的研究目的和意義。
　　 論文的研究工作主要分三章，第一章涉及的是亞細(xì)胞組分的免疫細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答；第二章研究的是蛋白復(fù)合物的相互作用組；第三章研究的是微流控芯片的實(shí)際樣品酶解。下面將詳細(xì)介紹各章內(nèi)容：
　　 (一)

3、蛋白質(zhì)組學(xué)解析特異性激動(dòng)劑引起的巨噬細(xì)胞TLR的天然免疫應(yīng)答
　　 用不同的細(xì)菌、病毒或激動(dòng)劑進(jìn)行刺激，抗原遞呈細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞，能夠表達(dá)不同的Toll樣受體(Toll-like receptor)，通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑，產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子活性和特定基因的表達(dá)。重要的是，這些炎癥信號(hào)最終靶向染色質(zhì)，引起基因表達(dá)的改變。為了深入理解特異性激動(dòng)劑引起的調(diào)控機(jī)理，在亞細(xì)胞組分水平上，我們分析了一個(gè)已知的TLR2激動(dòng)劑-Pa

4、m3CSK4所引起的活的巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化，利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了胞漿部分和染色質(zhì)相關(guān)部分差異表達(dá)的蛋白?？偣茶b定了1000多個(gè)蛋白，其中定量了540個(gè)蛋白，大約1/2的蛋白發(fā)生了差異表達(dá)，并采用WB進(jìn)行了部分蛋白如FHC、HSP90β、HSP70、14-3-3e、RS6和NF-κBp100等的驗(yàn)證，其結(jié)果與質(zhì)譜鑒定的定量結(jié)果一致；同時(shí)，對(duì)鑒定到的兩部分蛋白進(jìn)行了功能分類和討論，發(fā)現(xiàn)對(duì)于S1組分，差異表達(dá)的蛋白

5、主要參與了翻譯后修飾活動(dòng)、能量代謝、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞死亡等生物學(xué)活動(dòng)；而對(duì)于P3鑒定的蛋白，我們借助于生物信息學(xué)工具，繪制了鑒定到的核蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，通過對(duì)這些蛋白的功能分析，我們發(fā)現(xiàn)TLR2激動(dòng)劑刺激后差異表達(dá)的蛋白主要參與蛋白組-泛素化通路、DNA復(fù)制和修復(fù)、翻譯后等生物學(xué)過程；最后我們將所得的Pam3CSK4刺激巨噬細(xì)胞的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與今年Nature上(Nature，447，(7147)：972，2007)發(fā)表的LPS刺激

6、巨噬細(xì)胞的微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與前炎癥基因相關(guān)的一些蛋白其上調(diào)趨勢是一致的，而與抗微生物基因相關(guān)的蛋白其表達(dá)變化是不一致的，這進(jìn)一步說明了不同的TLRs激動(dòng)劑引起的天然免疫應(yīng)答的特異性。本章的工作從整體上對(duì)TLR激動(dòng)劑引起的全蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，這一結(jié)果將有助于系統(tǒng)了解TLR的信號(hào)通路，特別是對(duì)與TLR相關(guān)的免疫性疾病的診斷、治療、預(yù)防等具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 (二)TNF-α引起的14-3-3 epsilon蛋

7、白復(fù)合物的變化
　　 14-3-3蛋白是一種高度保守的酸性可溶性蛋白，現(xiàn)有的研究表明：14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控，涉及細(xì)胞凋亡、生長、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，為多功能蛋白。而腫瘤壞死因子(tumor necrosisfactor，TNF)是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷惡性腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子，可以通過不同的信號(hào)途徑導(dǎo)致細(xì)胞的生長或凋亡，其中一個(gè)很重要的發(fā)現(xiàn)就是其可以激發(fā)MAP3K信號(hào)途徑，招

8、募14-3-3蛋白，導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的活化。本章采用氨基酸同位素代謝標(biāo)記和表位標(biāo)記的雙標(biāo)記策略，以穩(wěn)定表達(dá)帶有標(biāo)簽的14-3-3 epsilon的大量293T細(xì)胞為研究對(duì)象，采用免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法，研究了TNF-α刺激下特定的14-3-3ε蛋白的相互作用。表位標(biāo)記的方法可以提高免疫沉淀效率，增加蛋白復(fù)合物鑒定的幾率；而以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的氨基酸同位素代謝標(biāo)記的定量方法可以有效去除非特異性結(jié)合蛋白。借助這種策略，除了靶蛋白外，我們還鑒定

9、到了包括已知相互作用的蛋白如CDC-37、HSP90、TAK1、TBK1等在內(nèi)的55個(gè)相互作用的蛋白。許多未經(jīng)報(bào)道的蛋白，如DDX21、RuvBL2、PPM1B、核糖體蛋白等被首次報(bào)道，并對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行了WB驗(yàn)證和生物學(xué)功能分類分析。我們先選擇已知的相互作用蛋白如HSP90、TAK1、TBK1做WB，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性、可行性，其WB結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；然后我們又選取了未報(bào)道的相互作用蛋白如DDX21、RuvBL2、PPM1B，做進(jìn)一

10、步驗(yàn)證，WB結(jié)果也與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與此同時(shí)，我們還比較了刺激前后14-3-3ε蛋白復(fù)合物的變化情況，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激前，鑒定到的蛋白主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、RNA結(jié)合、蛋白折疊、氧化還原調(diào)節(jié)、壓力應(yīng)答、細(xì)胞骨架等生物學(xué)活動(dòng)；而TNF-α刺激后，鑒定到有些蛋白參與了TNF信號(hào)通路和NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控活化，這一結(jié)果說明了TNF-α的特異性刺激。本章的研究結(jié)果將對(duì)理解細(xì)胞內(nèi)蛋白或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用的網(wǎng)絡(luò)具有重大意義。同時(shí)14-3-3蛋白與多種疾病有

11、關(guān)，深入認(rèn)識(shí)14-3-3蛋白可能為治療一些疾病開辟新思路。
　　 (三)微流控反應(yīng)器在復(fù)雜蛋白樣品的酶解
　　 前面幾章研究的蛋白差異表達(dá)譜和蛋白相互作用表達(dá)譜均采用的是膠上酶解的傳統(tǒng)方法，我們還與Dr.Liu研究小組合作，嘗試了用微流控芯片反應(yīng)器作為酶解實(shí)際蛋白樣品的平臺(tái)。首先我們用納米金膠多層膜組裝的微流控反應(yīng)器酶解從小鼠巨噬細(xì)胞中提取的水溶性蛋白，將酶解產(chǎn)物用兩維液相色譜與Qstar質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)進(jìn)行分離鑒定，并與

12、傳統(tǒng)的溶液酶解結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)芯片法和溶液酶解法鑒定到的蛋白分別是194和170個(gè)，顯然，兩者之間的結(jié)果是可比的，值得一提的是，芯片法酶解快速，幾秒鐘即可完成酶解，更具優(yōu)勢。
　　 我們還研究了納米金膠多層膜組裝的微流控反應(yīng)器酶解從巨噬細(xì)胞中提取的全蛋白，一次實(shí)驗(yàn)即鑒定了497個(gè)蛋白，并與膠上酶解鑒定到的蛋白結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)此種微流控芯片反應(yīng)器完全可以應(yīng)用于實(shí)際復(fù)雜樣品的酶解；但是由于不同的提取蛋白試劑或采用不同的質(zhì)譜鑒定