TNF-α誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的核蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡過(guò)程存在著一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，許多蛋白質(zhì)參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行過(guò)程。在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，許多蛋白質(zhì)在不同的亞細(xì)胞器間存在轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，包括質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和細(xì)胞核。其中細(xì)胞核是一個(gè)非常重要的細(xì)胞器，細(xì)胞凋亡的許多調(diào)控因子都是進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用的(如caspases、AIF和cytochromec等)。因此，分析細(xì)胞凋亡過(guò)程中核蛋白的動(dòng)態(tài)變化，將有可能發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。本課題的研究目的就是分析凋亡細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞核蛋白的

2、變化，尋找新的凋亡相關(guān)蛋白，并分析其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能的作用。 首先，用腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡，確定了細(xì)胞凋亡的合適的時(shí)相，采用細(xì)胞熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3活性測(cè)定等手段檢測(cè)TNF-α作用于B16細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，TNF-α能夠誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡，并具有時(shí)效關(guān)系。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，TNF-α作用于B16細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)

3、胞發(fā)生G1期阻滯。 為了尋找新的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，在TNF-α誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡36小時(shí)后收取細(xì)胞，分離了凋亡細(xì)胞，提取細(xì)胞核總蛋白質(zhì)，進(jìn)行二維電泳分離，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析，發(fā)現(xiàn)在凋亡細(xì)胞核中有11個(gè)蛋白發(fā)生了明顯的變化(蛋白濃度相差3倍以上)，其中6個(gè)蛋白下調(diào)，5個(gè)蛋白上調(diào)，對(duì)這11個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)分別進(jìn)行質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，初步鑒定出這些差異蛋白。 其中4個(gè)含量增加的蛋白(HSP84，calreticu

4、lin，vimentin，GAPDH)均直接或間接地參與細(xì)胞凋亡有關(guān)，另外一個(gè)含量增加的蛋白(plasminogen)尚未見其與細(xì)胞凋亡有關(guān)的報(bào)道。而6個(gè)含量降低的蛋白分別屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(guaninenucleotidebindingprotein，lamininreceptor1)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(heterochromatinprotein1alpha，heterogeneousnuclearribonucleoprotein

5、A3，heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1)和未知功能蛋白(nucleolarproteinNO38)。細(xì)胞凋亡過(guò)程中這些變化的核蛋白的發(fā)現(xiàn)將有助于深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是糖酵解過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，與ATP的合成密切相關(guān)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，GAPDH存在許多異構(gòu)體，其功能也不僅僅是參與能量代謝，還參與tRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA的復(fù)制和修復(fù)

6、，以及細(xì)胞內(nèi)吞等生命活動(dòng)過(guò)程。另外，GAPDH還與多種因素介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。 我們?cè)谘芯縏NF-α誘導(dǎo)的B16細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，凋亡組細(xì)胞核中GAPDH蛋白濃度較對(duì)照組明顯上調(diào)。那么GAPDH是否參與了神經(jīng)元以外其它細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程?為此，我們分析、觀察了TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程GAPDH的動(dòng)態(tài)變化以及這些變化對(duì)凋亡的影響。通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GAPDH誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)中的GAPDH的量

7、略有下降，而細(xì)胞核中GAPDH的量則明顯上升，說(shuō)明在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，GAPDH發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的GAPDH表達(dá)載體pEGFP-GAPDH，用此載體轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中GAPDH的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)GAPDH在TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中有明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，這可能是由于在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，只有少量的GAPDH參與核轉(zhuǎn)位，而通過(guò)普通熒光顯微鏡觀察很難分辨出來(lái)。

8、為了分析GAPDH核轉(zhuǎn)位對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，又構(gòu)建了帶有核定位信號(hào)的GAPDH表達(dá)載體pEGFP-GAPDH-NLS。用pEGFP-GAPDH-NLS轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，在陽(yáng)性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，帶有EGFP的GAPDH定位于細(xì)胞核中，但并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。這說(shuō)明在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，GAPDH存在核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象也許只是細(xì)胞凋亡過(guò)程的伴隨現(xiàn)象。 另外，用pEGFP-GAPDH和pEGFP-GAPDH-NLS載體分別轉(zhuǎn)染B16

9、細(xì)胞后，通過(guò)FACS分析了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周時(shí)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與只轉(zhuǎn)染pEGFP空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染GAPDH的細(xì)胞在60h時(shí)出現(xiàn)明顯的G1期阻滯現(xiàn)象。但尚不清楚GAPDH的高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯是否與細(xì)胞凋亡進(jìn)程有關(guān)。 總之，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)了TNF-α誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡過(guò)程中出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象；通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了11種核蛋白，它們可能參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程。另外，通過(guò)westernblot證明，TNF-α誘