擬Smac新型促凋亡多肽分子對凋亡下游蛋白質組的影響及誘導凋亡的研究.pdf

1、本研究分為六部分：
　　 實驗一：擬Smac促凋亡多肽的合成及其生物活性的初步研究
　　 目的：探討擬Smac 多肽的合成及其對膀胱癌細胞的促凋亡生物活性。
　　 方法：應用固相多肽合成技術，合成具有細胞膜穿透性SmacN7 融合多肽，經RP-HPLC 純化、純度分析，用質譜儀定性鑒定；通過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)、細胞增殖抑制率測定及流式細胞儀分析，研究其對低劑量絲裂霉素C誘導的膀胱癌T24細胞的凋亡促進作用

2、。
　　 結果：可穿透性融合多肽SmacN7 產物峰純度達95%以上，分子量為3278.08，質譜鑒定結果與合成預期結果完全一致；50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用12h～48h，腫瘤細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變；隨著SmacN7 濃度的增加或作用時間的延長,細胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯增加，藥物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分別為（9.62±1.07）%～（61.48±1.15）%、（24.17±1.02）%

3、～（72.86±1.68）%、（43.24±1.15）%～（84.91±1.74）%；腫瘤細胞凋亡率也明顯增加，分別為（6.12±1.16）%～（49.81±2.11）%、（13.47±1.15）%～（64.54±2.27）%、（28.91±1.08）%～（82.36±2.19）%。
　　 結論：固相合成的擬Smac 融合多肽SmacN7 為高純度的目的肽，能夠穩(wěn)定地轉入細胞內且利用率高，并有明顯促進低劑量絲裂霉素C誘導的膀胱癌

4、T24細胞凋亡的生物活性，為進一步研究膀胱腫瘤的生物治療積累了有價值的資料。
　　 實驗二：人工合成擬Smac 融合多肽促低劑量絲裂霉素C誘導膀胱癌細胞凋亡的研究
　　 目的：探討人工合成擬Smac 融合多肽（SmacN7）對低劑量絲裂霉素C(MMC)誘導的膀胱癌T24細胞凋亡的促進作用。
　　 方法：運用固相多肽合成技術人工合成SmacN7細胞可穿透性融合多肽，0.05mg/ml MMC誘導的膀胱癌T24細胞與

5、50 μg/L～500 μg/L的SmacN7 融合多肽共同孵育4h～48h后，采用Annexin－V熒光染色檢測腫瘤細胞凋亡；流式細胞術和MTT 比色檢測誘導后T24細胞凋亡率、增殖抑制率與SmacN7的時間和濃度效應關系。
　　 結果：50 μg/L～500 μg/L SmacN7作用4h～48h，腫瘤細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，隨著SmacN7 濃度的增加或藥物作用時間的延長，腫瘤細胞凋亡率也增加，12h 為5.67%～

6、56.12%，24h 為14.54%～65.24%，48h 為31.48%～87.23%，同時細胞增殖抑制率出現(xiàn)明顯增加，藥物作用12h、24h、48h后增殖抑制率分別為9.58%～63.42%、28.94%～72.3%、44.7%～87.12%。
　　 結論：SmacN7 能夠有效地促進低劑量絲裂霉素C誘導的膀胱癌T24細胞凋亡，并具有時間和濃度依賴性，為膀胱腫瘤的生物治療提供了新思路。
　　 實驗三：人工合成擬Sma

7、c多肽增強膀胱癌細胞化療敏感性的實驗研究
　　 目的：探討人工合成擬Smac細胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7對膀胱癌化療藥物敏感性的促進作用。
　　 方法：人工合成細胞可穿透性促凋亡融合多肽SmacN7；噻唑藍（MTT）檢測SmacN7 融合多肽對低劑量絲裂霉素C(MMC)誘導的膀胱癌T24細胞的相對存活率；Annexin V/PI 雙標流式細胞術檢測T24細胞的凋亡；Western blot檢測SmacN7融合多

8、肽與MMC 聯(lián)用后T24細胞內XIAP、Caspase-3 蛋白的表達；同時檢測Caspase-3活性及SmacN7 融合多肽與MMC 聯(lián)用對T24細胞的殺傷作用。
　　 結果：SmacN7 融合多肽能穿透細胞并與內源性XIAP結合，增加低劑量MMC誘導的T24細胞凋亡并呈時間和濃度依賴性；能顯著降低細胞內XIAP的表達水平，增強Caspase-3的表達及活性；在24h和48h，SmacN7+MMC組與單用MMC組相比，T24細

9、胞的存活率分別降低2.22 倍和3.61 倍。
　　 結論：人工合成擬Smac細胞可穿透性促凋亡融合多肽能夠促進化療藥物誘導的膀胱癌T24細胞凋亡，抑制細胞增殖，增強膀胱癌細胞對MMC的化療藥物敏感性。
　　 實驗四：擬Smac合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物的制備及性能研究
　　 目的：探討擬Smac合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物的制備及聯(lián)合恒定外磁場體外對膀胱癌細胞的凋亡促進作用。
　　 方法：以羧

10、甲基殼聚糖為骨架與具有超順磁性的Fe3O4納米粒合成納米載體粒子，將擬Smac 合成肽SmacN7與其結合，制備擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物，并通過透射電鏡、振動樣磁強計等考察其理化性質；Hoechst33258 染色觀察外加磁場下納米復合物誘導膀胱癌T24細胞凋亡的形態(tài)，MTT比色分析法觀察其對腫瘤細胞的生長抑制作用。
　　 結果：擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米粒子的粒徑約為46.2nm；磁化曲線提示具

11、有超順磁性；載藥量和包封率分別為（31.8±3.6）％和（65.2±2.4）％并具有良好的藥物控釋性能；外加磁場下磁性納米粒子能使腫瘤細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)改變并表現(xiàn)出顯著的生長抑制活性。
　　 結論：擬Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性納米復合物具有粒徑小、較強的磁響應性、超順磁性、載藥量和包封率高和良好的藥物緩釋性能，聯(lián)合恒定外磁場具有明顯的促進腫瘤細胞凋亡的作用，為膀胱腫瘤的生物治療提供了新的切入點。
　　 實驗五：

12、擬Smac 合成肽磁性納米顆粒誘導膀胱癌細胞凋亡的體外實驗研究
　　 目的：研究擬Smac 合成肽磁性納米顆粒的制備及其協(xié)同恒定外磁場體外對人膀胱癌T24細胞的生長抑制作用并探討其作用機制。
　　 方法：氧化還原法制備SmacN7-O-CMC-MNPS 并檢測其理化性質，倒置顯微鏡和電鏡觀察細胞形態(tài)，TUNEL法檢測細胞凋亡，MTT、流式細胞術分別觀察SmacN7-O-CMC-MNPS 聯(lián)合化療藥物及恒定外磁場體外對人膀

13、胱癌T24細胞的生長抑制作用，SABC法觀察Bcl-2/Bax 蛋白的表達，Western blot檢測XIAP 蛋白的表達。
　　 結果：SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒直徑46.2nm，呈球形，載藥量(31.8±3.6）%，磁響應性良好。含相同濃度SmacN7的單純SmacN7-O-CMC-MNPS對膀胱腫瘤T24細胞的生長抑制率和凋亡率無明顯影響，但協(xié)同外磁場及在化療藥物的誘導下其對腫瘤細胞的生長抑制作用明

14、顯增強；Bcl-2 蛋白表達水平下調同時Bax 蛋白的表達增強，外磁場組與化療藥物組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），協(xié)同外磁場時Western blot檢測不同時間XIAP 蛋白的表達顯著降低。
　　 結論：SmacN7-O-CMC-MNPS的制備不影響SmacN7的生物活性；恒定外磁場下其對腫瘤細胞的促凋亡作用明顯增強，為膀胱腫瘤的生物靶向治療奠定了實驗基礎。
　　 實驗六：擬Smac合成肽磁性納米顆粒在膀胱癌裸鼠移

15、植瘤靶向治療的體內實驗和機制研究
　　 目的：研究擬Smac合成肽磁性納米顆粒對膀胱癌裸鼠移植瘤的體內靶向治療作用并探討其機制。
　　 方法：40只荷瘤裸鼠隨機分成5組，每組8只，按不同組別(A、B、C、D、E組)給于不同治療，各組每天治療1 次，連續(xù)1wk，磁場組在腫瘤部位施加0.8T外磁場30min。觀察裸鼠的進食、活動及生長情況、測瘤體積并計算抑瘤率；治療后32d處死動物，HE染色和電鏡觀察細胞結構，采用SABC法

16、觀察Bcl-2/Bax 蛋白的表達，采用RT—PCR法檢測各組腫瘤組織XIAPmRNA和Caspase-3mRNA的表達，Western blot法檢測各組腫瘤組織XIAP和Caspase-3 蛋白表達。
　　 結果：治療期間及治療后各組裸鼠的進食、活動及生長情況未見明顯異常，體重差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05），SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加MMC 聯(lián)合外加磁場組（E組）移植瘤體積增長最為緩慢且對膀胱癌移植

17、瘤有明顯抑制作用，抑瘤率為58.4%，高于SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加MMC組（C組）(24.6%)和SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒加外加磁場組（D組）(32.2%)；免疫組化SABC法檢測E組Bcl-2蛋白表達水平下調同時Bax 蛋白的表達增強，與C、D組比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；RT—PCR結果示E組能顯著下調XIAPmRNA的表達，同時上調Caspase-3mRNA的表達；Wes