2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
  觀察曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ)預(yù)處理能否有效減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷,并探索心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧期間,曲美他嗪預(yù)處理是否經(jīng)過單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路調(diào)控自噬。
  研究方法:
  第一部分實(shí)驗(yàn):觀察H/R過程中曲美他嗪的保護(hù)作用,并確定最有效濃度。
  

2、構(gòu)建新生大鼠心肌細(xì)胞H/R模型,研究對象隨機(jī)分為對照組、H/R組、H/R+TMZ(10μM)組、H/R+TMZ(50μM)組、H/R+TMZ(100μM)組。采用MTS檢測細(xì)胞活性,收集培養(yǎng)液并通過試劑盒檢測LDH水平以觀察細(xì)胞損傷程度,比較各濃度療效,確定最有效濃度。
  第二部分實(shí)驗(yàn):探明曲美他嗪對H/R過程中自噬的影響及干預(yù)自噬表達(dá)對曲美他嗪療效影響
  本部分實(shí)驗(yàn)主要采用氯喹(chloroquine,Cq)抑制自噬流

3、,實(shí)驗(yàn)分組為對照組、對照+TMZ組、對照+Cq組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+Cq組、H/R+TMZ+Cq組。MTS檢測細(xì)胞活性,試劑盒檢測培養(yǎng)液LDH水平,并通過Western blot半定量分析自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3和p62的表達(dá),轉(zhuǎn)染病毒mRFP-GFP-LC3并通過共聚焦顯微鏡以測定細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白分布情況,透射電鏡直接觀察各組自噬體數(shù)量,TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡水平。
  第三部分實(shí)驗(yàn):探明H

4、/R過程中干預(yù)AMPK對曲美他嗪所調(diào)控的自噬的影響
  本部分實(shí)驗(yàn)主要使用compound C(com C)抑制AMPK信號,實(shí)驗(yàn)分組為對照組、對照+ com C組、H/R組、H/R+TMZ組、H/R+com C組、H/R+TMZ+ comC組。MTS檢測細(xì)胞活性,試劑盒檢測培養(yǎng)液LDH水平,最后通過Western blot半定量分析自噬相關(guān)蛋白LC3和p62及AMPK信號通路蛋白p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的表

5、達(dá)。
  研究結(jié)果:
  1.曲美他嗪預(yù)處理減輕心肌細(xì)胞H/R損傷
  與對照組相比,H/R組的細(xì)胞活性顯著性下降(P<0.05);各曲美他嗪預(yù)處理組細(xì)胞活性均比H/R組高(P<0.05),H/R+TMZ(50μM)組細(xì)胞活性比H/R+TMZ(10μM)組高(P<0.05),但與H/R+TMZ(100μM)組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。因此50μM為曲美他嗪的最有效濃度。
  2.曲美他嗪預(yù)處理在心肌細(xì)胞H/R

6、期間促進(jìn)自噬流
  H/R處理后各自噬相關(guān)蛋白均表達(dá)上調(diào)(P<0.05,C vs.H/R組),然而曲美他嗪預(yù)處理后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均進(jìn)一步增強(qiáng),p62減少(P<0.05,H/Rvs.H/R+ TMZ組);透射電鏡結(jié)果顯示,相比對照組,HR組細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)更多自噬體,(P<0.05);而相比H/R組,H/R+TMZ組自噬體數(shù)量進(jìn)一步增加(P<0.05)。共聚焦顯微鏡下,對照組無明顯LC3聚集現(xiàn)象;H/R處理

7、后,自噬體數(shù)量明顯增加(P<0.05,Cvs.H/R組);與H/R組相比,H/R+TMZ組的自噬溶酶體更多(P<0.05)。
  3.Cq預(yù)處理抵消曲美他嗪對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
  Cq預(yù)處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表達(dá)均增加(P<0.05,H/R+ TMZ vs.H/R+TMZ+Cq組);共聚焦顯微鏡下,Cq預(yù)處理顯著減少自噬溶酶體(P<0.05,H/R+TMZ vs.H/R+ TMZ+ Cq組);與H/R+T

8、MZ組相比,H/R+TMZ+Cq組細(xì)胞活性明顯下降(P<0.05);
  4.曲美他嗪預(yù)處理減少H/R中細(xì)胞凋亡
  TUNEL染色結(jié)果顯示,與對照組相比,H/R組凋亡細(xì)胞顯著性增加(P<0.05);曲美他嗪預(yù)處理后,凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05,H/R vs.H/R+ TMZ組);然而H/R+TMZ+Cq與H/R+ TMZ組相比,凋亡細(xì)胞顯著性增加(P<0.05)。
  5.曲美他嗪預(yù)處理通過AMPK-mTOR

9、調(diào)控H/R中的自噬
  與H/R組相比,曲美他嗪預(yù)處理顯著增加p-AMPK/AMPK的比值以及減少p-mTOR/mTOR的比值(P<0.05,H/R vs.H/R+ TMZ組);與H/R+ TMZ組相比,compound C減少p-AMPK/AMPK比值,增加p-mTOR/mTOR比值(P<0.05);此外,compound C減少LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并增加了p62的表達(dá);H/R+TMZ+com C與H/R+ TMZ組相比,

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