曲美他嗪對(duì)離體心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的自噬基因Beclin1的影響.pdf

1、目的：冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是心血管疾病中引起死亡的首要原因。隨著人們生活水平的提高，冠心病患者人數(shù)逐年上升，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者也明顯增多。目前臨床上治療急性心肌梗死主要采用溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（percutaneous coronary intervention， PCI）以及冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary arter

2、y bypass grafting，CABG）等手段以開通阻塞血管，挽救瀕死心肌，但隨之而來的缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷卻嚴(yán)重影響治療效果及患者預(yù)后，因此對(duì)于缺血再灌注損傷機(jī)制的研究越來越受重視。心肌缺血再灌注損傷涉及多種機(jī)制，包括氧自由基增多、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡等。近年來的研究表明，自噬是一種新的程序性死亡（II型程序性死亡）方式，成為新的研究熱點(diǎn)，并且被認(rèn)為在心肌缺血再灌注損

3、傷中發(fā)揮著重要作用。
　　自噬是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的受損或功能障礙的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器降解的過程。適度的自噬對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，過度的自噬則會(huì)加劇細(xì)胞死亡。研究表明，自噬在缺血再灌注損傷中表現(xiàn)出“雙刃劍”的作用，缺血期主要起保護(hù)作用，而再灌注期自噬過度激活則表現(xiàn)出損傷作用，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬的發(fā)生非常復(fù)雜，其中自噬體的形成是自噬發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自噬由大多數(shù)自噬基因（autophagy-related gene，Atg）進(jìn)行調(diào)控，其中

4、Beclin1基因是酵母Atg6的同系物，是形成自噬體的必需分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)基因定位于自噬體膜，并與多種蛋白反應(yīng)調(diào)控自噬體的形成與成熟。因此抑制Beclin1的表達(dá)可有效阻斷自噬的發(fā)生。
　　近年來心肌能量代謝藥物通過聯(lián)合常規(guī)改善血流藥物（硝酸酯類、β-受體阻滯劑、鈣拮抗劑等）治療心肌缺血備受關(guān)注，隨著心肌能量代謝研究的不斷深入，曲美他嗪優(yōu)化心肌代謝的作用機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)。曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）作為

5、調(diào)節(jié)心肌能量代謝的藥物，通過部分抑制游離脂肪酸的氧化，減少氧自由基產(chǎn)生，減輕鈣超載，發(fā)揮線粒體保護(hù)、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡等多方面的藥理作用，維持ATP的產(chǎn)生及缺血心肌細(xì)胞的能量代謝功能，從而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。但其對(duì)自噬的影響目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞為研究及觀察對(duì)象，利用離體心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧（hypoxia reoxygenation，HR）模型模擬心肌缺血再灌注損傷，并給予不同濃度的曲美他嗪

6、干預(yù)。比較各組心肌細(xì)胞活力、培養(yǎng)上清液LDH含量以評(píng)價(jià)各組心肌細(xì)胞的受損情況及曲美他嗪對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用；采用RT-PCR檢測(cè)自噬基因Beclin1 mRNA水平，以觀察自噬基因Beclin1在缺血再灌注損傷的表達(dá)情況及探討曲美他嗪對(duì)自噬基因Beclin1的影響，為臨床用藥提供新思路及依據(jù)。
　　方法：出生2-3天的健康Sprague Dawley（SD）乳鼠，來自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，提取并培養(yǎng)心肌細(xì)胞，并將心肌細(xì)胞

7、隨機(jī)分為5組：
　　1)正常對(duì)照組（A組）：含10％胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基（37℃、5%CO2、95%空氣）培養(yǎng)26.5h；
　　2) HR模型組（B組）：不含血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后，三氣培養(yǎng)箱（92%N2、5%CO2、3%O2）中培養(yǎng)24h，然后在含10％胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基（37℃、5%CO2、95%空氣）培養(yǎng)2h模擬缺血再灌注損傷；
　　3)0.2μmol/L曲美他嗪預(yù)處理組（C組）：含

8、0.2μmol/L曲美他嗪，不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后，建立HR模型，模擬缺血再灌注（同B組）；
　　4)1.0μmol/L曲美他嗪預(yù)處理組（D組）：含1.0μmol/L曲美他嗪，不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后，建立HR模型，模擬缺血再灌注（同B組）；
　　5)5.0μmol/L曲美他嗪預(yù)處理組（E組）：含5.0μmol/L曲美他嗪，不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30min后，建立HR模型，

9、模擬缺血再灌注（同B組）；
　　各組細(xì)胞處理后，應(yīng)用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力、全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)培養(yǎng)清乳酸脫氫酶（LDH）含量、采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定各組自噬基因Beclin1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.心肌細(xì)胞活力結(jié)果：B組心肌細(xì)胞活力為A組的61.26±6.30%（P<0.05），C組、D組、E組心肌細(xì)胞活力分別為A組的70.34±7.17%、79.33±6.90%、89.43±6.

10、02%，均明顯高于B組（P<0.05），其中E組高于C組、D組（P<0.05）；
　　2.乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定結(jié)果：B組、C組、D組、E組LDH含量分別為176.96±12.70 U/L、157.87±13.38 U/L、126.44±12.41U/L、97.13±12.14U/L均明顯高于A組的65.18±16.99U/L（P<0.05），C組、D組、E組LDH含量均低于B組（P<0.05），E組低于C組、D組（P<0.05

11、），與心肌細(xì)胞活力結(jié)果共同說明通過HR建立的離體IR模型是有效的，HR造成離體心肌細(xì)胞損傷，而曲美他嗪能減輕HR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，并具有一定的濃度依賴性；
　　3. RT-PCR結(jié)果：B組心肌細(xì)胞自噬基因Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A組，達(dá)A組的2.99±0.19倍（P<0.05），C組、D組、E組心肌細(xì)胞自噬基因Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（2.65±0.24、2.19±0.17、1.64±0.20）

12、均低于B組（P<0.05），尤以E組明顯，說明HR可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬基因Beclin1 mRNA水平增加，而曲美他嗪能抑制自噬基因Beclin1 mRNA的表達(dá)，并具有一定的濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞給予低糖、缺氧后復(fù)糖、復(fù)氧條件，能明顯降低心肌細(xì)胞活力，增加LDH含量，有效模擬缺血再灌注模型。
　　2.曲美他嗪能減輕缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷，并具有一定的濃度依賴性。
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