eRF3b和DRC3f抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝纖維化及其機制的體外研究.pdf

1、本實驗室的前期研究中，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測到在肝硬化、肝細胞肝癌、慢性肝炎患者血清中表達量不同的兩個小分子多肽:真核肽鏈釋放因子3b和脫精氨酸補體C3f。為了闡明eRF3b和DRC3f在慢性肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用，本課題選擇二者對肝纖維化的影響作為切入點，通過體外細胞培養(yǎng)，采用多肽片段合成和RNA干擾技術(shù)，在細胞和分子水平，研究二者對肝纖維化的影響，并進一步探討相關(guān)的分子和信號機制。
　　本課題包括以下三

2、部分研究:
　　第一部分 eRF3b和DRC3f抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細胞纖維化因子的表達
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC纖維化相關(guān)因子的表達的抑制作用
　　方法:①選用體外培養(yǎng)的人肝星狀細胞LX-2細胞株作為實驗對象，分別用不同濃度TGF-β1、eRF3b和DRC3f刺激HSC，MTT法篩選TGF-β1適宜作用劑量和多肽最佳作用劑量。②將eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)

3、質(zhì)粒表達載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1刺激的HSC，RT-realtime PCR測定相關(guān)基因mRNA表達;Westem blot測定相關(guān)基因蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.分別于24、48h，TGF-β1各濃度組的HSC增殖活力均高于對照組(P＜0.01)。于10ng/ml濃度達到增殖作用平臺期。
　　2.外

4、源性eRF3b氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達的影響。
　　3.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達的影響。
　　4.pGPU6-GSPT2 shRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達的影響。
　　5.外源性DRC3f氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC各因子表達的影響。
　　結(jié)論:
　　1.TGF-β1可激活HSC，誘導(dǎo)H

5、SC產(chǎn)生ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA等纖維化相關(guān)因子，成功構(gòu)建了TGF-β1激活HSC纖維性變模型。
　　2.在HSC內(nèi)TGF-β1的增加消耗GSPT2; eRF3b/DRC3f通過抑制TGF-β1mRNA和蛋白表達而發(fā)揮其作用。
　　3.外源性eRF3b氨基酸多肽、eRF3b基因上調(diào)、eRF3b基因沉默從多角度證明:eRF3b可通過TGF-β1通路抑制HSC ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA的表達。

6、r>　　4.外源性DRC3f基酸多肽可通過TGF-β1通路抑制HSC ColⅠ、ColⅢ、CTGF、α-SMA的表達，但作用相對較弱。
　　第二部分 eRF3b和DRC3f對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細胞周期的影響
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細胞周期的影響和機制
　　方法:分別用eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)質(zhì)粒表達載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-

7、C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1激活的HSC，MTT法實驗測定細胞增殖活力，PI標記流式細胞術(shù)檢測細胞周期，RT-real time PCR測定相關(guān)因子mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　1.eRF3b氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖和細胞周期的影響。
　　2.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增

8、殖和細胞周期的影響。
　　3.GSPT2基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖活力的影響。
　　4.DRC3f氨基酸多肽對HSC增殖和細胞周期的影響。
　　結(jié)論:①TGF-β1刺激HSC增殖作用最適宜作用濃度為10ng/ml。②eRF3b和DRC3f氨基酸多肽的最佳作用濃度均為100ng/ml。③eRF3b氨基酸多肽、eRF3b基因表達上調(diào)、基因沉默從多角度證明:eRF3b對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖有抑制作用;抑制

9、細胞周期S期，使細胞DNA合成阻滯在G0/G1期，其作用機制與Cyclin D1、CDK4、p21基因的調(diào)控有關(guān)。④DRC3f氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖有抑制作用;抑制細胞周期S期，使細胞DNA合成阻滯在G0/G1期，其作用機制基于對Cyclin D1、CDK4、p21基因表達的調(diào)控。⑤eRF3b和DRC3f抑制細胞增殖，抑制細胞周期S期和DNA合成可能是其抗纖維化的機制之一。
　　第三部分 eRF3b和DRC3f對

10、TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細胞凋亡和遷移的影響
　　目的:探討eRF3b和DRC3f對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響及其機制。
　　方法:將eRF3b和DRC3f氨基酸多肽，基因上調(diào)質(zhì)粒表達載體pEGFP-C2-GSPT2、pEGFP-C2-GSPT-111，基因沉默質(zhì)粒表達載體pGPU6-GSPT2 shRNA干預(yù)TGF-β1刺激的HSC，PI標記流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，劃痕實驗檢測HSC的遷移能力，RT-rea

11、l time PCR測定相關(guān)基因mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　1.外源性eRF3b氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響。
　　2.pEGFP-C2-GSPT2和pEGFP-C2-GSPT2-111對HSC凋亡和遷移的影響。
　　3.pGPU6-GSPT2 shRNA對HSC凋亡和遷移的影響。
　　(1)3個實驗組的HSC凋亡率分別為:1.66％，13.35％，5.53％，TGF組和TGF+

12、pGPU6-GSPT2 shRNA組細胞凋亡率比對照組顯著增多(P＜0.001)，TGF+pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組進一步升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.096)。
　　(2) TGF、pGPU6-GSPT2 shRNA組Bcl-2的表達量TGF組比對照組表達減少(P=0.008)，TGF+pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組數(shù)值上減少(P=0.650)。3組Bax和Fas的表達量TGF組比對照組升高(

13、P=0.005，0.001)，pGPU6-GSPT2 shRNA組比TGF組數(shù)值上進一步升高(P=0.002，0.766)。
　　(3)于24、48h，TGF組同等時間內(nèi)較對照組相對遷移距離大(P=0.001，＜0.001)，TGF+ pGPU6-GSPT2 shRNA組較TGF組進一步增加(P=0.002，0.222)。3個實驗組α-SMA mRNA的相對表達量TGF組比對照組表達升高(P＜0.001)，TGF+pGPU6-GS

14、PT2 shRNA組比TGF組進一步升高(P=0.009)。
　　4.外源性DRC3f氨基酸多肽對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡和遷移的影響
　　(1)于24、48h，3個實驗組的HSC凋亡率分別為:0.56％，4.66％，0.91％;1.66％，13.35％，3.08％，TGF組細胞凋亡率比對照組顯著增多(P＜0.001)，DRC3f組比TGF組減少(P＜0.001)。
　　(2)3組Bcl-2的表達量，僅數(shù)值上TGF

15、組較對照組表達減少(P=0.208)，TGF+DRC3f組較TGF組增加(P=0.204)。Bax和Fas的表達量TGF組比對照組表達升高(P=0.018，0.004)，TGF+DRC3f組比TGF組僅數(shù)值上降低(P=0.150，0.653)。
　　(3)2個時間點，TGF組同等時間內(nèi)較對照組相對遷移距離增大(P=0.002)，TGF+DRC3f組較TGF組減小(P=0.146，0.023)。TGF組和TGF+eRF3b組α-SM

16、A mRNA表達量TGF組比對照組升高(P＜0.001)，TGF+ DRC3f組比TGF組降低(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.eRF3b氨基酸肽、eRF3b基因上調(diào)、eRF3b基因沉默從多角度證明:eRF3b對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC凋亡有抑制作用。其機制可能與調(diào)控Bax、Fas、Bcl-2基因的表達有關(guān)。
　　2.從多角度證明:eRF3b對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC遷移有抑制作用。其作用機制可能與抑制HSC細