DRC3f及eRF3b在肝病發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、全世界大概有3.6億人口感染了乙型肝炎病毒，而長(zhǎng)期慢性感染容易發(fā)生肝硬化，肝失代償甚至誘發(fā)肝癌。盡管由于全球嬰兒乙肝疫苗免疫計(jì)劃的推行使得慢性肝炎發(fā)病率有所下降，但由于乙型肝炎病毒導(dǎo)致的肝癌的發(fā)病率至少在未來的20多年仍會(huì)上升。
　　 本室前期本著尋找早期生物標(biāo)志物用于臨床診斷的目的，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of f

2、light mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測(cè)到兩個(gè)小分子多肽，其中一個(gè)16個(gè)氨基酸的小肽經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜鑒定為脫精氨酸補(bǔ)體C3f(DRC3f)，乙型肝炎的輕度及中度病人血清中表達(dá)量高于重度病人血清。補(bǔ)體系統(tǒng)是人體免疫很重要的組成部分，補(bǔ)體在外周血中以非活性形式存在，除了具有非特異性防御及參與機(jī)體的一系列特異性免疫應(yīng)答外，在一些非免疫性因素的刺激下，補(bǔ)體亦可被活化產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并引起組織細(xì)胞損傷。補(bǔ)體中C3的含

3、量最高，在補(bǔ)體激活過程中，C3活化形成的C3b進(jìn)一步通過CR1或H因子幫助下由Ⅰ因子分解為滅活的iC3b和17肽C3f。后者在羧基肽酶-N作用下脫精氨酸，迅速生成16肽DRC3f。許多研究表明，補(bǔ)體C3包括C3f及其一些片段在疾病進(jìn)展中充當(dāng)了重要角色。
　　 檢測(cè)到的另一個(gè)37個(gè)氨基酸的多肽經(jīng)鑒定屬于真核肽鏈釋放因子eRF3b，慢性肝炎患者血清中該多肽含量較高，肝癌及肝硬化病人血清中含量較低。真核生物中終止蛋白合成需要兩類多肽釋

4、放因子，eRF1和eRF3。eRF1識(shí)別終止密碼子，激發(fā)肽?；鵷RNA鏈的水解，eRF3具有GTP酶活性，以GTP依賴的形式刺激eRF1釋放因子的活性。哺乳動(dòng)物中eRF3有兩種，即eRF3a和eRF3b，各有637及628個(gè)氨基酸，分別由GSPT1和GSPT2編碼，二者有87％的同源性。真核肽鏈釋放因子eRF3除了在翻譯終止過程中以GTP依賴的形式調(diào)節(jié)蛋白的合成外，還參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)相，參與腫瘤的形成等，盡管機(jī)制不是很清楚。研究顯

5、示eRF3a是哺乳動(dòng)物翻譯終止過程中的主要因子，它的表達(dá)水平?jīng)Q定著終止復(fù)合物的形成，而且目前大多數(shù)研究都是針對(duì)eRF3a所進(jìn)行的，但是在哺乳動(dòng)物中，eRF3b可以實(shí)現(xiàn)eRF3a在翻譯終止時(shí)的所有功能。第一部分脫精氨酸補(bǔ)體C3f(DRC3f)對(duì)體外肝細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用
　　 目的：作為補(bǔ)體激活的標(biāo)志，補(bǔ)體C3f以及DRC3f可以作為肝臟損傷的一種生物標(biāo)志物，可以為臨床診斷提供參考，但其參與乙肝的病理變化的機(jī)制尚不清楚，因此本研究將

6、對(duì)該多肽的作用機(jī)制做初步研究。
　　 方法：用含有DRC3f的血清以及固相合成的DRC3f刺激正常肝細(xì)胞QSG-7701，MTT法檢測(cè)對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響，并且提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ1以及一型膠原ColⅠ的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：輕、中、重度肝炎患者以及正常人的血清對(duì)QSG-7701細(xì)胞作用之后發(fā)現(xiàn)，輕度和中度肝炎血清對(duì)細(xì)胞刺激后的增殖較重度肝炎及正常血清快，F(xiàn)值為55.715

7、，P＜0.01。將血清用3Kd的超濾管超濾之后作用于細(xì)胞，可以觀察到同樣的效果，F(xiàn)值為26.325，P＜0.01。為了進(jìn)一步確認(rèn)，本研究應(yīng)用合成的DRC3f刺激QSG-7701細(xì)胞，同時(shí)以星狀細(xì)胞LX-02作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的DRC3f對(duì)肝細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對(duì)星狀細(xì)胞影響不大。實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定結(jié)果顯示，隨著DRC3f的劑量的增加，TGFβ1和COLⅠ的表達(dá)下降，以18S rRNA為內(nèi)參，與未刺激組比較，TGFβ1的表達(dá)為0.96（

8、62.5 ng．mL-1組）、0.42（500ng．mL-1組）；COLⅠ的表達(dá)為0.93（62.5ng．mL-1組）、0.57（500ng．mL-1組）。
　　 結(jié)論：DRC3f對(duì)肝細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并且隨著劑量的增加，細(xì)胞因子TGFβ1和COLⅠ的表達(dá)下降。
　　 第二部分真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：在腫瘤形成過程中，腫瘤細(xì)胞的變化如蛋白合成率的增加、參與細(xì)胞周期增

9、殖的某些特異蛋白的過表達(dá)往往和翻譯因子的變化有關(guān)，一系列的證據(jù)支持真核翻譯因子如翻譯起始因子、延伸因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色，但是關(guān)于釋放因子的研究甚少，所以本研究將探討真核肽鏈釋放因子eRF3b在肝組織及不同細(xì)胞株的表達(dá)情況，為下一步機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：利用免疫組化法分析eRF3b在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)定量PCR中以18s rRNA為內(nèi)參照，用2-△△Ct法對(duì)GSPT2、ERF1以及GSPT1在正常

10、肝細(xì)胞QSG-7701、肝癌細(xì)胞HepG2、HBV整合的肝癌細(xì)胞HepG2.215中的mRNA水平進(jìn)行分析，RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，以α-tublin為內(nèi)參照，Western Blot檢測(cè)eRF3b蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：4對(duì)肝組織標(biāo)本（癌和癌旁組織）的免疫組化結(jié)果顯示，eRF3b在實(shí)質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，不同細(xì)胞株細(xì)胞爬片的免疫組化結(jié)果顯示eRF3b在胞質(zhì)表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示GSPT2在各細(xì)胞株的表

11、達(dá)有所差異，在HepG2細(xì)胞中表達(dá)量高于QSG-7701以及HepG2.215細(xì)胞，而ERF1以及GSPT1在HepG2.215中表達(dá)量明顯高于其他兩種細(xì)胞株。Western Blot檢測(cè)中，以α-tublin為內(nèi)參照，肝癌細(xì)胞珠HepG2的相對(duì)表達(dá)量0.73，其它兩個(gè)細(xì)胞株分別為0.25及0.24，eRF3b在HepG2中表達(dá)量高于其它兩個(gè)細(xì)胞株，而QSG-7701與HepG2.215細(xì)胞中eRF3b表達(dá)量沒有差異。
　　 結(jié)

12、論：eRF3b在肝組織及培養(yǎng)的細(xì)胞株中陽性表達(dá)，以HepG2細(xì)胞株的表達(dá)較高。
　　 第三部分外源性eRF3b對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響
　　 目的：通過上調(diào)或下調(diào)eRF3b在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)而對(duì)eRF3b在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行初步研究。
　　 方法：構(gòu)建綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察蛋白的定

13、位，同時(shí)構(gòu)建短發(fā)卡干擾RNA的表達(dá)載體pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，pSilencer2.1-GSPT2轉(zhuǎn)染組記為eRF3b(-)，pSilencer2.1-GSPT1轉(zhuǎn)染組記為eRF3a（-）。轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒后應(yīng)用Western Blot法觀察目的蛋白表達(dá)量的變化，MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活力變化，平板克隆形成試驗(yàn)分析eRF3b對(duì)單細(xì)胞克隆增殖的影響，流式細(xì)

14、胞儀測(cè)定細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察蛋白定位于胞質(zhì)；細(xì)脆固定后，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為65.1％，pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期沒有影響。shRNA表達(dá)質(zhì)粒pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1進(jìn)行測(cè)序證

15、實(shí)構(gòu)建成功，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，0h、24h及54h分別收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot測(cè)定，發(fā)現(xiàn)干擾54h能夠沉默58％左右的蛋白表達(dá)；MTT測(cè)定結(jié)果顯示，eRF3b干擾組吸光度均值為0.1893(N=18)，eRF3a干擾組吸光度均值為0.147(N=18)，pSilencer對(duì)照組吸光度均值為0.259(N=18)，eRF3b干擾組及eRF3a干擾組細(xì)胞活力都較對(duì)照組下降，與eRF3b干擾組比較，eRF3a干擾組細(xì)胞

16、活力較低；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明eRF3b的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞增殖能力的下降。流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)eRF3b的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞周期的改變：與pSilencer對(duì)照組比較，eRF3b（-）組G1期細(xì)胞百分比由28.9％上升至65％，S期細(xì)胞百分比由41％減少至20.1％。
　　 結(jié)論：干擾GSPT2mRNA表達(dá)后細(xì)胞周期改變，G1期細(xì)胞百分比增多，而且eRF3b的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞的活力以及增殖能力下降，上述結(jié)果為了解eRF3