MiR-29b對HER2過表達(dá)型乳腺癌生長與侵襲的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌(Breast cancer，BC)是女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌的分子分型是根據(jù)雌/孕激素受體(ER/PR)、人表皮生長因子受體2（HER2）及增殖細(xì)胞核抗原Ki-67，乳腺癌可分為以下幾種分型:管腔型，即luminal型，包括luminalA型和luminal B型;HER2過表達(dá)型和三陰型。研究已經(jīng)證實，乳腺癌的分子病理進程涉及多種微小RNA（microRNAs，miRNAs）的異常表達(dá)。
　　目

2、前尚無miR-29b在HER2過表達(dá)型乳腺癌中功能和作用機制的研究，因此在本研究中我們將關(guān)注miR-29b對HER2過表達(dá)型乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響，探索其發(fā)揮作用的機制，這可能為HER2過表達(dá)型乳腺癌患者的診斷和治療提供新的思路和靶點。
　　方法:
　　一、MiR-29b在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　1.乳腺癌組織、癌旁組織標(biāo)本及臨床病理資料的收集
　　收集2012.11-2013.11南方醫(yī)院手術(shù)切

3、除的乳腺癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本67例，腫瘤組織經(jīng)臨床病理檢查診斷均為原發(fā)性乳腺癌。配對的癌旁組織取自距離腫瘤組織邊緣5cm。組織標(biāo)本用10％福爾馬林固定，石蠟包埋。患者在手術(shù)切除腫瘤前未接受過局部或者系統(tǒng)治療。
　　2.腫瘤組織與癌旁組織中MiR-29b的檢測
　　應(yīng)用QIAGEN公司miRNeasy FFPE KIT提取石蠟組織標(biāo)本中的總RNA，運用實時熒光定量PCR法檢測miR-29b表達(dá)量。
　　3.癌組織mi

4、R-29b表達(dá)水平的判定
　　實時熒光定量PCR實驗重復(fù)三次，采用相對定量法計算組織miR-29b表達(dá)水平:腫瘤組織(Cancer，C)和癌旁組織(Normal，N)各取平均Ct值，以U6 snRNA作為內(nèi)參，計算兩組的2-ΔΔCt值;以U6 snRNA和癌旁組織作為對照，計算腫瘤組織相對與癌旁組織的相對表達(dá)量(C/N)，數(shù)據(jù)經(jīng)log10轉(zhuǎn)換，當(dāng)＜0時定義為表達(dá)下降;當(dāng)≥0定義為表達(dá)升高。
　　二、上調(diào)miR-29b表達(dá)對H

5、ER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響
　　細(xì)胞株檢測中發(fā)現(xiàn)HER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435和SK-BR-3中miR-29b的表達(dá)水平較正常乳腺上皮細(xì)胞和其他表型乳腺癌細(xì)胞均顯著降低，選擇這兩株細(xì)胞進行下一步的細(xì)胞學(xué)實驗。
　　1.細(xì)胞株的培養(yǎng)條件
　　人乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3細(xì)胞選用McCoy'5a培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗，MDA-MB-435選用DMEM培養(yǎng)基（高糖）+胎牛血清10％+

6、1％的雙抗，置于37℃，5％ CO2，95％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.MiR-29b mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-435及SK-BR-3細(xì)胞
　　使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株，miR-29b mimics的最終轉(zhuǎn)染濃度為50nm，轉(zhuǎn)染后通過熒光定量PCR法檢測是否過表達(dá)成功。
　　3.上調(diào)miR-29b表達(dá)對MDA-MB-435及SK-BR-3細(xì)胞增殖及侵襲的影響
　　轉(zhuǎn)染miR-2

7、9b mimics之后，經(jīng)CCK-8實驗、Transwell細(xì)胞侵襲實驗、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡及裸鼠皮下移植瘤實驗，觀察miR-29b在體內(nèi)外對HER2過表達(dá)型乳腺癌增殖、細(xì)胞周期和凋亡及侵襲能力的影響。
　　三、MiR-29b下游靶基因的預(yù)測和確定及其對STAT3調(diào)控作用的研究
　　1.構(gòu)建野生型STAT33'UTR（STAT3_WT）和突變型STAT33'UTR(STAT3_MUT)質(zhì)粒。
　　2.雙熒

8、光素酶活性檢測:miR-29b mimics/scramble與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩株乳腺癌細(xì)胞，48小時后檢測雙熒光素酶活性變化。
　　3.通過熒光定量PCR法檢測MDA-MB-435和SK-BR-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染MiR-29bmimics/scramble后STAT3 mRNA的變化。
　　4.使用Western-blot法檢測轉(zhuǎn)染miR-29b mimics后，MDA-MB-435和SK-BR-3細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白表達(dá)量的變化。<

9、br>　　四、STAT3參與miR-29b介導(dǎo)的對HER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　1.細(xì)胞株的培養(yǎng)條件
　　SK-BR-3和MDA-MB-435培養(yǎng)條件同前所述。
　　2.si-STAT3/control轉(zhuǎn)染MDA-MB-435及SK-BR-3細(xì)胞
　　使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后通過熒光定量PCR檢測STAT3 mRNA、Western-blot法檢測STAT3

10、蛋白水平，驗證siRNA是否成功敲低STAT3。
　　3.下調(diào)STAT3表達(dá)對HER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響
　　轉(zhuǎn)染si-STAT3/control之后，經(jīng)CCK-8實驗、Transwell細(xì)胞侵襲實驗、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實驗，觀察兩不同處理組乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞周期和凋亡的變化情況。
　　4.Rescue實驗（靶標(biāo)蛋白回復(fù)實驗）進一步證實HER2過表達(dá)型乳腺癌中miR-29b對STAT3

11、的直接調(diào)控作用
　　五、MiR-29b對STAT3及其下游信號分子表達(dá)的影響
　　Western-blot法分別檢測轉(zhuǎn)染si-STAT3/control和miR-29b mimic/scramble的兩株細(xì)胞中STAT3及其下游信號分子的蛋白表達(dá)情況。免疫組化檢測兩個不同處理組（miR-29b mimic/scramble轉(zhuǎn)染組）裸鼠瘤塊中STAT3與HER2的表達(dá)情況。
　　結(jié)論:
　　一、與癌旁正常組織相比，

12、miR-29b在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著下降，其表達(dá)水平與腫瘤大小、HER2的表達(dá)狀態(tài)相關(guān)，腫瘤最大徑≥5cm、HER2陽性是乳腺癌患者miR-29b表達(dá)量降低的獨立危險因素;所有分子分型中，miR-29b在HER2過表達(dá)型患者中的表達(dá)水平最低，提示miR-29b在乳腺癌尤其是HER2過表達(dá)型乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌功能。
　　二、與正常乳腺細(xì)胞和其他分子分型乳腺癌細(xì)胞相比，MiR-29b在HER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞SK-B

13、R-3及MDA-MB-435中的表達(dá)水平顯著降低，與組織學(xué)檢測結(jié)果一致，過表達(dá)miR-29b在體內(nèi)外均能抑制HER2過表達(dá)型乳腺癌細(xì)胞的生長。
　　三、HER2過表達(dá)型乳腺癌中，STAT3是miR-29b的靶基因，miR-29b能與STAT3 mRNA3'UTR區(qū)互補結(jié)合，在mRNA和蛋白兩個水平負(fù)向調(diào)控STAT3表達(dá)。
　　四、敲低STAT3和過表達(dá)miR-29b取得的生物學(xué)效應(yīng)一致，均可以抑制HER2過表達(dá)型乳腺癌的生長