多菌靈耐受細菌YF-2T,YF-3T的分離鑒定及多菌靈水解酶基因的表達.pdf

1、多菌靈是一類廣譜、內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑，在中國乃至世界范圍生產(chǎn)和使用范圍極廣。多菌靈的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中半衰期較長，隨著多菌靈的使用量逐年增大，在環(huán)境中的積累越來越多，其對生態(tài)環(huán)境造成的不利影響愈加凸顯。多菌靈在環(huán)境中的降解過程主要通過微生物進行，國內(nèi)外學(xué)者分離得到多株多菌靈降解菌株均為革蘭氏陽性細菌。本實驗從長期施用多菌靈的土壤中分離純化得到兩株具有多菌靈極強耐受性的革蘭氏陰性細菌YF-2T(1000mg·l-1)、YF-3T(

2、1200mg·l-1)，本文對它們進行了多項分類研究。
　　菌株YF-2T呈革蘭氏陰性，無鞭毛，無運動性，不形成芽孢，細胞呈短桿狀(0.4-0.6μm×2.3-2.6μm)。在R2A培養(yǎng)基平板培養(yǎng)8小時后，菌落呈淺黃色，濕潤，透明，易于挑取，直徑約為1mm，呈飽滿的圓形，邊緣光滑整齊，具有金屬光澤。YF-2T的生長條件為:25～37℃，pH5.0～8.0，氯化鈉濃度0～5％(w/v)。YF-2T所含脂肪酸的主要成分為summed

3、feature3(C16∶1ω7c and/or C16∶1ω6c)，iso-C15∶0，iso-C17∶03-OH，C16∶0以及anteiso-C15∶0;所含醌的主要組成成分為:MK-6;極性脂主要包含磷脂酰乙醇胺(PE)，未知的極性脂(L1-L7)以及未知的氨基脂(AL1-AL3)。總DNA G+C mol％含量為35.2mo1％。菌株YF-2T與黃桿菌屬（Flavobacterium）內(nèi)模式菌株Flavobacteriumak

4、iainvivensCIP110358T和Flavobacterium hauense KCTC32147T的16S rRNA基因序列相似性分別為95.99％以及95.92％。綜合分析，將YF-2T鑒定為黃桿菌屬（Flavobacterium）的一個新種，并命名為Flavobacterium shanxiense sp.nov.(=CCTCCAB2014079T=JCM30153T)。
　　菌株YF-3T呈革蘭氏陰性，無鞭毛，無運

5、動性，不形成芽孢，細胞呈短桿狀(0.5～0.7μm×2.1～2.3μm)。在TSA培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)12小時后，菌落呈圓形，橘黃色，透明，中間凸起，邊緣光滑整齊，具有金屬光澤。YF-3T的生長條件為:25～37℃，pH5.0～8.0，氯化鈉濃度0～5％(w/v)。YF-3T所含脂肪酸的主要種類為iso-C15∶0，iso-C17∶03-OH,summed feature9(iso-C17∶1ω9cand/or C16∶010-met

6、hyl)以及summed feature3(C16∶1ω7c and/or C16∶1ω6c);所含醌的主要組成成分為:MK-6;極性脂主要包含磷脂酰乙醇胺(PE)，未知的極性脂(L1-L5)以及未知的氨基脂(AL1-AL2);所含多胺主要成分為:對稱篙精胺以及亞精胺。菌株YF-3T與參比菌株Chryseobacterium hispalenseAG13T(16S rRNA基因序列相似性為98.71％)的基因組DNA同源性為31.7±2

7、.1（33.5±3.6），與參比菌株Chryseobacterium taiwanense BCRC17412T（16S rRNA基因序列相似性為96.93％)的基因組DNA同源性為28.4±5.4(25.7±4.4)，均低于70％。綜合分析，將YF-3T鑒定為金黃色桿菌屬（Chryseobacterium）的一個新種，并命名為Chryseobacterium shandongense sp.nov.(=CCTCC AB2014060T

8、=JCM30154T)。
　　多菌靈降解的關(guān)鍵步驟是在多菌靈水解酶基因(mheⅠ)的作用下將多菌靈降解為2-氨基苯并咪唑。以實驗室保存的多菌靈降解菌mbc-1的多菌靈水解酶基因（mheⅠ）密碼子為基礎(chǔ)，通過密碼子優(yōu)化并合成適合在枯草桿菌表達的mheⅠ基因。將優(yōu)化后mheⅠ克隆到穿梭質(zhì)粒pP43NMK上，該質(zhì)粒以強啟動子P43和分泌效率較高的nprB基因的信號肽作為表達元件，接著將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pP43NMK-mheⅠ轉(zhuǎn)化到枯草桿