多菌靈對(duì)雄性大鼠生殖毒性機(jī)制的研究.pdf

1、多菌靈(carbendazim),又稱(chēng)為棉萎靈、苯并咪唑44號(hào)、BCM、貝芬替(臺(tái)灣)等,為工農(nóng)業(yè)上常用的苯并咪唑類(lèi)殺菌劑,也是苯菌靈(benomyl)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和在環(huán)境中的降解產(chǎn)物。我國(guó)是多菌靈生產(chǎn)和使用的大國(guó),其年產(chǎn)量超過(guò)10000噸,約占我國(guó)殺菌劑總量的1/4。雖然多菌靈毒性低(LD50＞5000mg/Kg),但其降解速度緩慢,易殘留。已有報(bào)道,多菌靈能引起雄性大鼠生育能力降低、睪丸萎縮和精子異常等,而其作用機(jī)制

2、尚不明確,因此有必要進(jìn)行多菌靈對(duì)雄性大鼠生殖毒性機(jī)制研究。
　　 研究目的：
　　 通過(guò)建立Hershberger試驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究多菌靈的雄激素和抗雄激素樣效應(yīng),探討多菌靈對(duì)雄性大鼠生殖毒性的作用途徑和特征;通過(guò)睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)研究,闡明睪丸支持細(xì)胞是否為多菌靈的效應(yīng)靶點(diǎn);擬通過(guò)以上兩部分研究初步探討多菌靈雄性生殖毒性的毒作用機(jī)制,為今后苯并咪唑類(lèi)化學(xué)物的雄性生殖毒性的深入研究、認(rèn)識(shí)苯并咪唑類(lèi)化學(xué)物對(duì)環(huán)境生態(tài)平衡的危害

3、和人類(lèi)生殖健康的威脅及采取有效的預(yù)防措施提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 研究方法的：
　　 56只5周齡健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠,適應(yīng)環(huán)境1周后,按Hershberger試驗(yàn)方法建立無(wú)內(nèi)源性雄激素動(dòng)物模型。將試驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)睪丸切除,術(shù)后恢復(fù)7天,隨機(jī)分為7組,設(shè)溶劑對(duì)照組(玉米油)、陰性對(duì)照組(丙酸睪酮+玉米油)、陽(yáng)性對(duì)照組(丙酸睪酮+氟他胺)、多菌靈組(丙酸睪酮+多菌靈20/100/200mg/kg.bw)、溶劑+多菌

4、靈組(玉米油+多菌靈200mg/kg.bw),每組8只,連續(xù)染毒10天,丙酸睪酮和氟他胺以玉米油為溶劑。各組于末次染毒24小時(shí)后,稱(chēng)取體重,處死大鼠,依次分離雄激素依賴(lài)組織,最后分離肝臟、腎臟組織。各組織取出后用濾紙吸去組織上的血液和組織液,立即于萬(wàn)分之一分析天平上稱(chēng)重,計(jì)算臟器系數(shù),分析質(zhì)量變化。
　　 多菌靈對(duì)睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究采用18～20天雄性健康清潔級(jí)Wistar大鼠,通過(guò)胰酶、膠原酶二步酶消化法分離獲取細(xì)胞,

5、再通過(guò)Tris-Hcl低滲等處理進(jìn)行細(xì)胞純化,采用HE染色、瑞氏.吉姆薩染色進(jìn)行支持細(xì)胞的鑒定。用MTT法進(jìn)行濃度為0、0.1、1、10、100μg/ml的多菌靈對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖的影響觀察。檢測(cè)多菌靈對(duì)睪丸支持細(xì)胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果
　　 1.無(wú)內(nèi)源性雄激素動(dòng)物模型
　　 去勢(shì)手術(shù)后大鼠恢復(fù)良好,未出現(xiàn)傷口感染和死亡情況。動(dòng)物給予受試物后均未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。各組

6、動(dòng)物給藥前初始體重、給藥結(jié)束終體重量及增重與陰性對(duì)照組比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各劑量組動(dòng)物肝、腎器官臟器系數(shù)與陰性對(duì)照組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＞0.05)。陰性對(duì)照組大鼠雄激素依賴(lài)組織臟器系數(shù)與溶劑對(duì)照組比較,顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05;P＜0.01);陽(yáng)性對(duì)照組大鼠雄激素依賴(lài)組織臟器系數(shù)較陰性對(duì)照組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05;P＜0.01)。
　　 2.多菌靈的雄激素和抗雄激素樣效

7、應(yīng)研究
　　 利用建立的無(wú)內(nèi)源性雄激素模型研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)多菌靈劑量組中大鼠雄激素依賴(lài)組織臟器系數(shù),與陰性對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。溶劑+多菌靈組大鼠雄激素依賴(lài)組織臟器系數(shù)與溶劑對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而與陰性對(duì)照組比較,均顯著降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05;P＜0.01)。
　　 3.睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定
　　 采用胰蛋白酶和膠原酶兩步法分離,多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)

8、定,從每只Wistar大鼠睪丸中約可獲取107個(gè)睪丸支持細(xì)胞,分離細(xì)胞成活率為95％左右。睪丸支持細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng),胞體呈長(zhǎng)柱狀或不規(guī)則型,有多個(gè)突起,細(xì)胞核為卵圓形或不規(guī)則型,典型可見(jiàn)核內(nèi)衛(wèi)星核小體。
　　 4.多菌靈對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖的影響
　　 MTT結(jié)果顯示,在24 h、48 h和72 h時(shí),多菌靈0、0.1、1μg/ml劑量組對(duì)睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在5％以下,而10、100μg/ml劑量組對(duì)睪丸支持細(xì)

9、胞都存在明顯的抑制作用,并在72 h時(shí)表現(xiàn)最為明顯,分別為31％和34.87％。
　　 5.多菌靈對(duì)波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表達(dá)的影響
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,低劑量組多菌靈未明顯影響睪丸支持細(xì)胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表達(dá),而10、100μg/ml劑量組能明顯抑制睪丸支持細(xì)胞波形蛋白、α-微管蛋白和β-微管蛋白的表達(dá)。
　　 研究結(jié)論的：
　　 1.本研究參照Hershb

10、erger試驗(yàn)方法能夠建立起穩(wěn)定的無(wú)內(nèi)源性雄激素動(dòng)物模型,成功的動(dòng)物模型可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.在本次給藥劑量下,多菌靈對(duì)雄性大鼠雄激素依賴(lài)組織朱產(chǎn)生影響,未發(fā)現(xiàn)其具有雄激素/抗雄激素樣效應(yīng)。多菌靈引起的雄性生殖毒性,可能不是通過(guò)干擾激素途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.本研究通過(guò)胰酶、膠原酶二步消化法,獲取原代睪丸支持細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Tris-Hcl低滲等處理純化后,通過(guò)HE染色、瑞氏.吉姆薩染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定,證明我們獲取的