纖維素酶作為融合蛋白在大腸桿菌中的應(yīng)用及其分泌機(jī)制的研究.pdf

1、大腸桿菌的遺傳系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，遺傳背景清晰，技術(shù)手段成熟，是目前較常用的蛋白表達(dá)菌株，多用于重組蛋白及藥物蛋白的生產(chǎn)。但是在實(shí)際應(yīng)用中，除了缺少翻譯后的修飾系統(tǒng)外，大腸桿菌在表達(dá)異源蛋白時(shí)會(huì)由于積累大量錯(cuò)誤折疊的目的蛋白，形成難以復(fù)性的包涵體結(jié)構(gòu)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員提出了一系列的解決方法，如使用不同的啟動(dòng)子調(diào)控蛋白的表達(dá)水平、共表達(dá)分子伴侶、降低培養(yǎng)溫度或者將目的蛋白以融合蛋白的形式分泌到菌體周質(zhì)空間或胞外表達(dá)。
　　其中，

2、融合蛋白的分泌表達(dá)具有很多優(yōu)勢(shì)，例如簡(jiǎn)化了下游純化程序，避免了蛋白酶的降解，周質(zhì)空間的環(huán)境利于蛋白質(zhì)的正確折疊，并且胞外積累目的蛋白可以減少對(duì)菌體代謝及生長(zhǎng)的抑制作用等。在生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化方面，由于纖維素類的大分子底物無(wú)法直接被大腸桿菌菌體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)分解利用，重組酶的胞外分泌表達(dá)也是成功的關(guān)鍵因素。
　　但是，在革蘭氏陰性菌中蛋白質(zhì)的分泌需要穿過(guò)兩層膜結(jié)構(gòu)。因此，大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下并不具有很強(qiáng)的分泌能力。融合載體蛋白的選擇不

3、僅決定了目的蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)位置，也影響到了目的蛋白的最終分泌量。目前較常用的融合蛋白載體主要有兩類:1）信號(hào)肽序列，可以將目的蛋白特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間，如Sec途徑信號(hào)肽及TAT途徑信號(hào)肽序列;2）大腸桿菌中過(guò)表達(dá)檢測(cè)到的可分泌蛋白，一般可以通過(guò)某一未知的外膜途徑將目的蛋白攜帶分泌至胞外，如內(nèi)源性蛋白OsmY，YebF等。
　　本文利用之前研究中所發(fā)現(xiàn)的一個(gè)于芽孢桿菌的纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域(Cel-CD)，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)時(shí)可以被高

4、效的分泌至胞外，具有作為融合載體蛋白的應(yīng)用前景。所以選定Cel-CD作為本研究的目標(biāo)蛋白驗(yàn)證其在融合蛋白分泌表達(dá)方面的應(yīng)用，并通過(guò)進(jìn)一步對(duì)Cel-CD在大腸桿菌中的分泌機(jī)制的檢測(cè)確定了Cel-CD的N端氨基酸對(duì)于其可溶性表達(dá)及分泌的作用。隨后，利用Cel-CD分泌表達(dá)融合蛋白的特性及其自身的纖維素內(nèi)切酶活性構(gòu)建了可將纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為PHB的細(xì)胞工廠。
　　一、Cel-CD高效分泌表達(dá)的機(jī)理研究
　　由于在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證

5、Cel-CD的分泌是經(jīng)過(guò)周質(zhì)空間的兩步法過(guò)程，并且是不依賴于自身原始信號(hào)肽序列的。Cel-CD自身序列的N端20個(gè)氨基酸同時(shí)起到了穿內(nèi)膜及外膜分泌的信號(hào)肽作用。
　　通過(guò)前期的氯霉素抑制SecA蛋白活性實(shí)驗(yàn)以及本章節(jié)利用N20融合GFP蛋白的熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，確認(rèn)Cel-CD在大腸桿菌中是通過(guò)SecB依賴的Sec途徑穿內(nèi)膜到達(dá)大腸桿菌的周質(zhì)空間。而大腸桿菌外膜上存在的兩步法分泌孔道主要有二型分泌系統(tǒng)(T2SS)，五型分泌系統(tǒng)(T5SS

6、)及外膜蛋白(OMPs)。通過(guò)敲除E.coli BL21(DE3)菌株相關(guān)蛋白的基因后檢測(cè)Cel-CD的胞外積累，發(fā)現(xiàn)Cel-CD的分泌并沒(méi)有受到抑制。因此，推斷Cel-CD在大腸桿菌中通過(guò)某一未知的途徑分泌到胞外。
　　由于在對(duì)Cel-CD序列分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)其不具有各型分泌系統(tǒng)的信號(hào)肽序列性質(zhì)，也沒(méi)有相關(guān)的信號(hào)肽酶酶切位點(diǎn)。將N20與其他常用的Sec途徑信號(hào)肽進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)N20的n-region帶有負(fù)電荷，整個(gè)N20的二級(jí)結(jié)

7、構(gòu)預(yù)測(cè)顯示為無(wú)規(guī)則卷曲并且具有明顯的親水性及極性，并不具有傳統(tǒng)信號(hào)肽的n-region、h-region及c-region的特征。
　　為了檢測(cè)N20序列上對(duì)Cel-CD分泌起關(guān)鍵作用的氨基酸位點(diǎn)，利用隨機(jī)誘變?cè)噭┖袑?duì)N20序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，檢測(cè)突變株胞外分泌量的變化。由于大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，誘變株的分泌量變化既受穿內(nèi)膜效率變化的影響也受穿外膜效率變化的影響。誘變結(jié)果顯示，N20氨基酸序列疏水性提高及二級(jí)結(jié)構(gòu)

8、的改變（生成α-螺旋）都會(huì)引起穿內(nèi)膜分泌量的提高，但外膜分泌受到一定程度的抑制。通過(guò)與其他可分泌蛋白的N端的替換實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。以上結(jié)果說(shuō)明，N20的分泌信號(hào)肽作用是折中了內(nèi)膜及外膜分泌條件的結(jié)果。
　　二、Cel-CD作為融合蛋白的應(yīng)用
　　在章節(jié)中，以Cel-CD為目標(biāo)蛋白檢測(cè)其在大腸桿菌中的應(yīng)用。首先構(gòu)建了Cel-CD的表達(dá)載體，發(fā)酵檢測(cè)其在大腸桿菌中的分泌。通過(guò)DNS法檢測(cè)胞外Cel-CD酶活，證明分泌到

9、胞外的Cel-CD具有纖維素內(nèi)切酶酶活。并通過(guò)電鏡檢測(cè)，證明表達(dá)菌體細(xì)胞膜完整，排除了菌體裂解對(duì)胞外Cel-CD積累的影響。也排除了Cel-CD的酶活對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性造成的影響。
　　前期通過(guò)N端的缺失實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)驗(yàn)證了Cel-CD的N端20個(gè)氨基酸對(duì)于其胞內(nèi)可溶性表達(dá)及分泌起到了重要作用。在本章節(jié)中，進(jìn)一步通過(guò)N端20個(gè)氨基酸殘基與PelB的替代實(shí)驗(yàn)，證明了N端20個(gè)氨基酸同時(shí)起到了穿內(nèi)膜及外膜分泌的信號(hào)肽作用。
　　隨后

10、，選取了5組不同來(lái)源的蛋白質(zhì)與Cel-CD及N20融合表達(dá)，以驗(yàn)證Cel-CD及N20是否具有攜帶底物蛋白可溶性表達(dá)及分泌的能力。通過(guò)對(duì)各發(fā)酵組上清的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cel-CD與底物蛋白的融合可以有效的提高其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并可以將5組目的蛋白全部攜帶分泌至胞外，但是分泌效率受底物蛋白分子量的影響較大。而N20融合5組不同來(lái)源的底物蛋白后，對(duì)其可溶性的提高影響并不明顯，但是在可溶性表達(dá)的基礎(chǔ)上，均可以將底物蛋白融合攜帶至胞外。進(jìn)一

11、步檢測(cè)了融合蛋白表達(dá)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，與對(duì)照組相比，Cel-CD及N20融合蛋白對(duì)于菌體生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的影響。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為Cel-CD及N20均具有在大腸桿菌中作為載體蛋白分泌表達(dá)的能力，但適用范圍不同。
　　為了進(jìn)一步增加融合蛋白的可溶性及分泌效率，嘗試對(duì)培養(yǎng)基以及N端信號(hào)肽拷貝數(shù)做了優(yōu)化。文獻(xiàn)報(bào)道，TB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富并富含磷酸鹽緩沖體系。使用TB培養(yǎng)基代替LB發(fā)酵檢測(cè)N20融合蛋白的可溶性表達(dá)及分泌。結(jié)果顯示，TB培養(yǎng)

12、基針對(duì)原本就可溶的N20融合蛋白的可溶性表達(dá)具有促進(jìn)作用，并可以進(jìn)一步增加其分泌量。但對(duì)于不可溶的N20融合蛋白并沒(méi)有顯著作用。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了N20融合對(duì)于底物蛋白可溶性并沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，但可以較高效的將目的蛋白攜帶分泌至胞外。
　　由于N20具有穿內(nèi)外膜信號(hào)臺(tái)作用，為了提高信號(hào)強(qiáng)度，在N20序列的N端又增加了PelB信號(hào)肽序列以增加N端的信號(hào)肽序列數(shù)。選取了與N20后僅胞內(nèi)可溶性表達(dá)的堿性磷酸酶作為底物蛋白進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)。實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果顯示，添加了pelB信號(hào)肽的實(shí)驗(yàn)組可以通過(guò)周質(zhì)空間被進(jìn)一步分泌至胞外。因此，認(rèn)為增加N端信號(hào)肽數(shù)目對(duì)于N20融合蛋白的分泌能力具有較好的促進(jìn)作用，但其適用范圍還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證明。
　　三、Cel-CD作為雙功能蛋白的應(yīng)用
　　在前期的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)驗(yàn)證分泌到胞外的Cel-CD具有較好的纖維素內(nèi)切酶活性，并且具有攜帶其他目的蛋白分泌到胞外的能力。利用Cel-CD作為融合載體蛋白，選取了來(lái)源于嗜熱裂胞菌的β-葡聚糖苷酶T

14、fu0937與其融合表達(dá)。在大腸桿菌中，融合蛋白Cel-Tfu0937可以被高效的分泌至胞外。通過(guò)酶活檢測(cè)融合蛋白的胞外活性，發(fā)現(xiàn)既有纖維素內(nèi)切酶活性也具有β-葡聚糖苷酶活性。因此具有構(gòu)建大腸桿菌纖維素細(xì)胞工廠的潛力。
　　PHB是一類可以被生物降解的聚酯，因此被廣泛的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在融合蛋白表達(dá)菌株中引入一條PHB合成途徑——包含有乙酰乙酯輔酶A、β-酮硫酶以及PHB合酶的質(zhì)粒，作為纖維素發(fā)酵利用的驗(yàn)證產(chǎn)物。選取了纖維素類物質(zhì)

15、CMC作為發(fā)酵底物，在不添加葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體檢測(cè)到了少量的PHB積累。結(jié)果證明，構(gòu)建了一株可以利用纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)PHB的大腸桿菌，提供了一株有效利用纖維素為唯一碳源積累生物能源物質(zhì)的基礎(chǔ)菌株。
　　進(jìn)一步使用纖維素類物質(zhì)的酶解產(chǎn)物——纖維二糖，作為唯一碳源做發(fā)酵檢測(cè)。由于體系中不再需要纖維素內(nèi)切酶的作用，構(gòu)建了N20-Tfu0937融合蛋白，并檢測(cè)到了胞外蛋白分泌及相應(yīng)的β-葡聚糖苷酶酶活。不添加葡萄糖的培養(yǎng)基