外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔股骨頭壞死實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:富集同種異體兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(PB-MSCs)，采用液氮冷凍方法制備兔股骨頭壞死模型，經(jīng)股骨頭原位注射的方法將PB-MSCs移植到股骨頭局部缺血壞死部位，繼而觀察移植療效，為評(píng)價(jià)外周血作為股骨頭壞死組織損傷修復(fù)的供體細(xì)胞新來(lái)源提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:(1)兔PB-MSCs的分離、培養(yǎng)與免疫表型鑒定:選用2～3月齡新西蘭大白兔，按30μg/(kg·d)劑量連續(xù)背部皮下注射G-CSF動(dòng)員6d，第7d取兔外周血2

2、0 mL，采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，用含20％FBS的LG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行PB-MSCs原代培養(yǎng)，適時(shí)換液并棄除未貼壁的血細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80％～90％時(shí)，按2～5×105/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞，分別用流式細(xì)胞術(shù)(CD29、CD14)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)對(duì)分離培養(yǎng)的兔PB-MSCs進(jìn)行表型鑒定。(2)兔股骨頭壞

3、死模型的制備:采用成年新西蘭大白兔，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉動(dòng)物(劑量為30 mg/kg)，無(wú)菌條件下手術(shù)逐層分離臀肌以顯露股骨頭;棉簽蘸取液氮，對(duì)股骨頭軟骨面負(fù)重區(qū)進(jìn)行反復(fù)冷凍、復(fù)溫以制備股骨頭壞死模型。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞移植:實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組。液氮冷凍后，用直徑1.2 mm鉆頭從髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組兩組動(dòng)物股骨頸的內(nèi)后側(cè)與股骨頸方向呈30度角手動(dòng)鉆入

4、股骨頭內(nèi)5mm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下，髓心減壓組鉆孔后，隨即復(fù)位股骨頭;髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔后，注射入用400μL生理鹽水懸浮的第2～3代PB-MSCs（含細(xì)胞總數(shù)3～4×106個(gè)）;術(shù)后逐層關(guān)閉各組動(dòng)物創(chuàng)口。(5)移植效果評(píng)價(jià):于術(shù)后2w、4w、6w、8w隨機(jī)選取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行髖關(guān)節(jié)X線攝片，以檢測(cè)骨密度、新生骨小梁等移植后病損修復(fù)情況;攝片后分別隨機(jī)選取各時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭，縱行剖開(kāi)股骨頭，一半進(jìn)行固定、脫鈣、常規(guī)

5、石蠟包埋、切片（厚5μm）及HE染色，置光鏡下觀察組織病理學(xué)修復(fù)情況;另一部分股骨頭則迅速置于液氮罐中保存，用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，以檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各分組股骨頭PPAR-γ、BMP-2 mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:(1)家兔PB-MSCs培養(yǎng)形態(tài)與表型特征:原代培養(yǎng)第7～8d時(shí)形成大小不等的細(xì)胞集落，細(xì)胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形，而后集落擴(kuò)大，細(xì)胞數(shù)明顯增多，以梭形為主，到10 d左右時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80

6、％以上;傳代培養(yǎng)的PB-MSCs形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形漩渦狀生長(zhǎng)。FCM分析結(jié)果顯示PB-MSCs表達(dá)CD29，不表達(dá)CD14;免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，PB-MSCs表達(dá)CD44、CD105、CD90，不表達(dá)CD34和CD45。(2)移植療效的X線攝片結(jié)果:正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)股骨頭無(wú)異常改變。模型組2w時(shí)股骨頭呈現(xiàn)密度增高影像;4w時(shí)股骨頭呈現(xiàn)密度不均影像，骺板尚清晰;至6w時(shí)，股骨頭外形變得不規(guī)則，邊緣有透亮區(qū)，關(guān)節(jié)間隙略增寬，骺板較清

7、晰;8w時(shí)，股骨頭明顯塌陷，縮小，關(guān)節(jié)間隙增大，骺板模糊。股骨頭大體形態(tài)隨時(shí)間推移，其受損程度呈加重演變特點(diǎn)。髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組兩組動(dòng)物術(shù)后2w時(shí)股骨頭密度均有所增加;4w時(shí)，兩組股骨頭整體密度均較2w時(shí)為增高，兩組股骨頭邊緣密度有所增高;6w時(shí)，兩組股骨頭整體均表現(xiàn)為骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，呈現(xiàn)密度不均影像，但各組標(biāo)本整體密度較之前均有所增加，髓心減壓+PB-MSCs移植組股骨頭高密度影像清晰可見(jiàn)，整體密度高于髓心減壓

8、組;8w時(shí)，髓心減壓組股骨頭整體密度進(jìn)一步增高，呈現(xiàn)為中心區(qū)域低密度，邊緣高密度，并出現(xiàn)硬化線;髓心減壓+PB-MSCs移植組股骨頭密度整體增高，并出現(xiàn)正常的骨小梁結(jié)構(gòu)。(3)移植療效的組織病理學(xué)分析:正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)骨小梁均完整，排列規(guī)則。模型組2w時(shí)出現(xiàn)骨小梁斷裂、排列紊亂，脂肪細(xì)胞融合成小囊;4w時(shí)髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞出現(xiàn)壞死;骨小梁周圍纖維組織增生;6w時(shí)修復(fù)區(qū)出現(xiàn)纖維化骨的爬行替代;8w時(shí)骨小梁斷裂，細(xì)胞被擠壓變形，可見(jiàn)類骨質(zhì)和骨

9、小梁等新生骨組織生成。髓心減壓+PB-MSCs移植組2w時(shí)，鉆孔區(qū)出現(xiàn)大量新生骨小梁和類骨質(zhì);4w時(shí)，兩組鉆孔區(qū)均出現(xiàn)較多新生骨小梁和骨髓組織;6w時(shí)，髓心減壓組鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁已趨成熟，髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔區(qū)出現(xiàn)大量的骨小梁和骨髓組織;8w時(shí)髓心減壓組鉆孔區(qū)邊緣仍有修復(fù)現(xiàn)象，鉆孔區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量骨髓組織，骨小梁分布不均，髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁已趨成熟，并有大量骨髓組織形成。(4)PPAR-γ和BMP-2表

10、達(dá)的熒光定量PCR結(jié)果:模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)PPAR-γ mRNA的表達(dá)量均高于正常組(P＜0.05)，其中PPAR-γmRNA在造模后2～6 w，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)(P＜0.05);髓心減壓組PPAR-γ mRNA的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于模型組(P＜0.01)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，至8 w時(shí)又明顯上升;髓心減壓+PB-MSCs移植組PPAR-γ mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出與模型組相同的

11、趨勢(shì)，但均明顯低于相對(duì)應(yīng)模型組的表達(dá)量;8w時(shí)，髓心減壓+PB-MSCs移植組PPAR-γ mRNA表達(dá)量明顯低于髓心減壓組(P＜0.01)。模型組各時(shí)間點(diǎn)BMP-2mRNA的表達(dá)量明顯低于正常組（P＜0.01），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組BMP-2mRNA的表達(dá)量變化不明顯;髓心減壓組BMP-2 mRNA的表達(dá)量明顯低于相對(duì)應(yīng)正常組的表達(dá)(P＜0.01);髓心減壓+PB-MSCs移植組BMP-2 mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高再下降而后又