益腎通絡(luò)法干預(yù)異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療激素性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:隨著激素在臨床的廣泛使用，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率逐漸上升。盡管有各種各樣的理論，然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確，且由于早期診斷率低且缺乏有效的治療方法，許多患者最終不得不行手術(shù)治療，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)藥治療激素性股骨頭壞死療效滿意，且積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，但單純中醫(yī)治療也存在不足。探討如何將中醫(yī)藥的治療優(yōu)勢與組織工程技術(shù)有機(jī)結(jié)合，尋求一種綜合療法，對提高臨床治療激素性股骨頭壞死的療效，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高生活質(zhì)量具有重要意義

2、。
　　目的:制備激素性兔股骨頭壞死模型（SANFH），通過組織工程骨(BMSCs/DBM)的髓芯減壓植骨術(shù)聯(lián)合中藥治療股骨頭壞死，觀察其對壞死股骨頭的骨陷窩數(shù)及毛細(xì)血管數(shù)影響，以期為臨床治療激素性股骨頭壞死尋找較好的解決途徑。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)分為四個(gè)部分。
　　第一部分，甲強(qiáng)龍聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)兔股骨頭壞死模型的建立。30只健康雄性新西蘭兔，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(20只)和對照組(10只)，實(shí)驗(yàn)組耳緣靜脈注射脂多糖(LPS)

3、10μ g/kg，24h后肌注甲強(qiáng)龍20mg/kg，1次/d，共3d。對照組注射同等劑量的生理鹽水。6周后觀察兔股骨頭X射線、μCT及病理學(xué)等指標(biāo)的改變。
　　第二部分，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分離、培養(yǎng)及鑒定。健康2周齡純種新西蘭大白兔1只，空氣栓塞處死后，解剖分離出雙下肢，剪斷股骨、脛骨兩端骨骺，反復(fù)沖洗骨髓腔和干骺端，采用全骨髓培養(yǎng)法分離出BMSCs，取第3代細(xì)胞觀察其形態(tài)并繪制生長曲線。
　　第三部分，同種異

4、體脫鈣骨(DBM)的制備及與兔BMSCs復(fù)合培養(yǎng)。健康雄性新西蘭兔，空氣栓塞處死后，取四肢長骨骨端及髂骨，剖成0.3cm×0.4cm×0.4cm大小骨塊，脫水、脫鈣、脫脂后，37℃烤箱干燥，玻璃瓶密封后環(huán)氧乙烷消毒。將制備好的DBM加入24孔板培養(yǎng)，同時(shí)加入密度為5×106/ml的第3代BMSCs，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光鏡下觀察，復(fù)合培養(yǎng)1周后備用。
　　第四部分，組織工程骨(BMSCs/DBM)的髓心減壓植骨術(shù)聯(lián)合

5、中藥治療股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究。成年新西蘭兔30只，建立兔激素性股骨頭壞死模型，隨機(jī)分為五組:A髓芯減壓+干細(xì)胞復(fù)合同種異體脫鈣骨移植組十中藥復(fù)方灌胃組;B髓芯減壓+干細(xì)胞復(fù)合同種異體脫鈣骨移植組;C髓芯減壓+中藥復(fù)方灌胃組;D單純中藥復(fù)方灌胃組;E單純髓芯減壓組。分別于術(shù)后2、4、8周時(shí)處死動(dòng)物，行X線、MRI檢查，組織病理切片染色后，在光鏡下觀察新骨痂及新生骨組織的聯(lián)結(jié)情況。所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，定量指標(biāo)以均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)

6、差描述。多組對比分析，定量資料符合正態(tài)分布用方差分析，不符合正態(tài)分布用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。組間兩兩比較，P≤0.05為差異有顯著性意義，P≤0.01為差異有非常顯著性意義，P＞0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　第一部分，X線示股骨頭密度減低，骨小梁模糊不清，可見一囊狀透亮區(qū)，股骨頭保持完整;μCT示結(jié)論:模型組股骨頭骨小梁稀疏，股骨頭可見部分塌陷;病理:骨小梁纖細(xì)，部分骨小梁斷裂，髓腔內(nèi)造血細(xì)胞

7、減少，脂肪細(xì)胞體積增大，有的融合成泡狀。大劑量激素能夠成功安全便捷地誘導(dǎo)兔股骨頭壞死動(dòng)物模型。
　　第二部分，BMSCs形態(tài)觀察原代培養(yǎng)7天見散在少量貼壁細(xì)胞，呈梭形、多角形或不規(guī)則狀，周圍有大量雜質(zhì)圓形細(xì)胞;傳代一次培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈梭形、多角形，雜質(zhì)細(xì)胞明顯減少;第二次傳代后細(xì)胞增殖快，呈多角形或不規(guī)則狀，培養(yǎng)5天即可鋪滿皿底;至第三代BMSCs細(xì)胞外觀呈長梭形，緊密排列，符合BMSCs細(xì)胞生長形態(tài)特征。

8、r>　　第三部分，BMSCs有效地復(fù)合到了同種異體脫鈣骨(DBM)上，同種異體脫鈣骨具有較好的細(xì)胞相容性，BMSCs能在其表面和孔隙內(nèi)附著、生長、增殖。第6天時(shí)，BMSCs與同種異體脫鈣骨聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞增殖達(dá)穩(wěn)定期，構(gòu)建了理想的組織工程骨，此時(shí)為該組織工程骨移植的最佳時(shí)機(jī)。
　　第四部分，(1)X線攝片:術(shù)后2周時(shí)各組股骨頭骨密度均降低，差異無顯著性意義。術(shù)后4、8周時(shí)各組骨密度有不同程度增高，其中A組和B組骨移植區(qū)的高密度影高于C

9、、D、E組。
　　(2)MRI:術(shù)后2周各組均可見明顯壞死區(qū)低信號(hào)改變。術(shù)后4、8周各組壞死低信號(hào)區(qū)未見有明顯擴(kuò)大，但整個(gè)股骨頭形態(tài)尚正常，A、B低信號(hào)區(qū)范圍明顯縮小，骨密度增高;C組低信號(hào)范圍縮小;D、E組兩組低信號(hào)區(qū)基本無變化。
　　(3)組織學(xué)觀察:術(shù)后2周各組均可見骨小梁纖細(xì)，部分骨小梁斷裂，脂肪細(xì)胞體積增大;A、B組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增生，有原始毛細(xì)血管形成。術(shù)后4周A組可見骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨母細(xì)胞分化，同時(shí)形成纖

10、維狀骨痂;B、C組骨痂相對A組較少，仍可見少量空骨陷窩;D、E組骨痂稀少，毛細(xì)血管稀少，骨化趨向不明顯。術(shù)后8周A組修復(fù)區(qū)域增大，骨細(xì)胞更趨于成熟;B組頭下纖維增多，局部毛細(xì)血管豐富，可見血小板、紅細(xì)胞結(jié)構(gòu);C組骨細(xì)胞體積增大，多角形，相鄰骨細(xì)胞距離增大;D、E組纖維結(jié)締組織及新生骨組織明顯少，骨形態(tài)不均一，少量區(qū)域有軟骨化骨痂形成，部分仍為未成熟區(qū)。
　　(4)空骨陷窩率和血管計(jì)數(shù)。各組在2周，4周，8周逐漸降低，同一時(shí)間點(diǎn)BM

11、SC+中藥+減壓組較其余各組低(P＜0.05);中藥+減壓組較中藥組和髓芯減壓組低(P＜0.05);BMSC+減壓組較中藥組和髓芯減壓組低(P＜0.05);中藥+減壓組和BMSC+減壓組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中藥組和髓芯減壓組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。血管計(jì)數(shù)與空骨陷窩率趨勢相反。
　　結(jié)論:(1)甲強(qiáng)龍聯(lián)合脂多糖能夠誘導(dǎo)兔早期股骨頭缺血性壞死模型，且方法簡單、快速，更加接近人早期股骨頭缺血壞死。

12、>　　(2)全骨髓培養(yǎng)法能簡便、快捷地分離出純度較高的BMSCs，第3代BMSCs生長性狀穩(wěn)定，增殖能力強(qiáng)，且具有干細(xì)胞特性。
　　(3)同種異體脫鈣骨制備簡單，能提供給種子細(xì)胞天然的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)還具有骨傳導(dǎo)和一定的骨誘導(dǎo)的作用，有利于骨移植的愈合。
　　(4)應(yīng)用益腎通絡(luò)法干預(yù)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人工骨復(fù)合體治療激素性股骨頭壞死有較好的療效，能促使血管生成，增加血流量，減輕和改善骨組織的缺血狀況，使激素性股骨頭缺血性壞死