淫羊藿苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1、兔股骨頭壞死模型制備:通過液氮冷凍法制備兔股骨頭壞死模型，探討兔股骨頭壞死的病理學(xué)變化過程，為研究股骨頭壞死提供更多可參考的造模方法。
　　2、淫羊藿苷濃度篩選:通過檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的效果，篩選出最佳濃度和最佳時(shí)間。
　　3、兔股骨頭壞死研究:在液氮冷凍法成功制備兔股骨頭壞死的模型的基礎(chǔ)上，聯(lián)合髓芯鉆孔減壓術(shù)，在保障細(xì)胞活性與數(shù)量的前提下，將經(jīng)淫

2、羊藿苷體外誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入股骨頭壞死減壓區(qū)，以期達(dá)到阻止骨破壞和促使新骨形成，增強(qiáng)修復(fù)成骨能力，提高股骨頭壞死治療效果，為臨床探索股骨頭壞死治療方案提供理論支持。
　　方法:
　　1.淫羊藿苷誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究:取生長1周健康新西蘭白兔體外提取骨髓間充質(zhì)原代干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選取具有較高繁殖力的二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)0～10μMol淫羊藿苷體外誘導(dǎo)24h、48h、72h，制作各濃度各時(shí)間點(diǎn)樣本，經(jīng)MT

3、T檢測(cè)、ALP活性檢測(cè)、ALP染色、茜素紅染色等技術(shù)檢測(cè)，結(jié)合熒光定量PCR測(cè)定BMP2、COL-1、OPN基因上調(diào)情況、western blot技術(shù)測(cè)定BMP2、COL-1、OPN蛋白表達(dá)影響。所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，篩選出最佳濃度、最佳時(shí)間點(diǎn)淫羊藿苷體外誘導(dǎo)出最佳活性和增殖能力的干細(xì)胞，與能夠提供營養(yǎng)并保持細(xì)胞活性的載體基質(zhì)膠混合備用，基質(zhì)膠冷凍保存呈液體，在22～35℃能夠快速成膠。
　　2.淫羊藿苷體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)

4、胞移植修復(fù)股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究:選取60只健康成年兔納入本實(shí)驗(yàn)，將其分為A組（空白對(duì)照12只），B組（模型組12只），C組（髓芯減壓治療組12只），D組（髓芯減壓聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組12只），E組（髓芯減壓聯(lián)合淫羊藿苷誘導(dǎo)形成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組12）。采用改良式液氮冷凍法制備股骨頭壞死兔的動(dòng)物模型，術(shù)后2周隨機(jī)取3只實(shí)驗(yàn)兔，麻醉下行X線、螺旋CT檢查后采用耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖取材，行Micro-CT檢查及病理組織形態(tài)

5、學(xué)檢測(cè)，多項(xiàng)檢測(cè)確保造模成功。減壓組、干細(xì)胞組、淫羊藿苷組分批行髓心鉆孔減壓術(shù)，干細(xì)胞組、淫羊藿苷組在股骨頭壞死減壓區(qū)注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、經(jīng)過淫羊藿苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組分別于術(shù)后2周、4周、8周隨機(jī)取3只實(shí)驗(yàn)兔在麻醉下行X線、螺旋CT檢查，行耳緣靜脈空氣栓塞處死，解剖取材，行Micro-CT Micro-CT三維重建及骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)計(jì)算、病理組織學(xué)HE染色、免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)股骨頭壞死區(qū)的修復(fù)情況。各組所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

6、析，得出結(jié)論。
　　成果:
　　1、采用液氮冷凍法成功制備兔股骨頭壞死模型:通過影像學(xué)及病理組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)證實(shí)了液氮冷凍術(shù)后2周即出現(xiàn)兔股骨頭壞死的典型表現(xiàn)，并獲得各實(shí)驗(yàn)組股骨頭壞死病理演變過程的客觀數(shù)據(jù)。
　　2、成功提取、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，篩選出了淫羊藿苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳濃度和最佳時(shí)間點(diǎn)，選定了基質(zhì)膠和誘導(dǎo)后干細(xì)胞混合物以保障植入壞死區(qū)細(xì)胞活性的方法。
　　3、成功獲得各組兔股骨頭壞死各時(shí)間點(diǎn)檢

7、測(cè)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為臨床股骨頭壞死的研究提供了理論支持。
　　結(jié)論:
　　1、液氮冷凍法制備兔股骨頭壞死模型，術(shù)后2周經(jīng)影像學(xué)及病理組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)股骨頭骨小梁變細(xì)稀疏，排列混亂并有部分?jǐn)嗔?，骨髓腔?nèi)造血細(xì)胞減少，細(xì)胞變性死亡，空骨陷窩明顯增多，此類骨細(xì)胞輪廓消失、核固縮，髓腔內(nèi)充血、凝血，并有大量壞死組織碎片存在，股骨頭負(fù)重區(qū)骨陷窩內(nèi)軟骨細(xì)胞萎縮、核固縮，為股骨頭壞死病理學(xué)的典型表現(xiàn)，證實(shí)了液

8、氮冷凍術(shù)后2周即可制備兔股骨頭壞死模型。
　　2、0～10μMol淫羊藿苷體外誘導(dǎo)二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24h、48h、72h的檢測(cè)結(jié)果顯示:淫羊藿苷作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48h，隨著濃度的增加，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目增加，在48h內(nèi)淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有增殖作用，在1州時(shí)增殖活性最高。淫羊藿苷作用時(shí)間為72h時(shí)，BMSCs的增殖能力下降，分化能力增強(qiáng)。淫羊藿苷促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和風(fēng)化的最佳濃度是1μMol，最佳時(shí)間點(diǎn)是48h

9、。
　　3、通過Micro-CT對(duì)股骨頭內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)觀察，模型組股骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂稀疏、間距增寬、數(shù)量減少，部分存在骨小梁骨折，股骨頭骨形態(tài)變小，骨礦鹽密度明顯減少，而經(jīng)過治療的髓芯減壓組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，淫羊藿苷組股骨頭壞死病變都有所改善，且淫羊藿苷組效果最好。以上結(jié)果表明，淫羊藿苷聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死效果明顯，淫羊藿苷通過誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成熟來發(fā)揮治療作用的。統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)Micro-CT掃描所得骨結(jié)構(gòu)主