二甲雙胍對內(nèi)皮祖細胞分化、遷移及成血管功能的影響和調(diào)控機制的實驗研究.pdf

1、深靜脈血栓形成（Deep vein thrombosis，DVT）是血管外科的常見病、多發(fā)病，是由于血管內(nèi)皮損傷、血流緩慢及血液高凝狀態(tài)等原因?qū)е碌难寒惓ＤY(jié)，以下肢最為多見。急性期，有進展為股青腫，造成肢體靜脈性壞疽的風險；一旦游離血栓脫落，則引起非致死性或致死性肺動脈栓塞(pulmonary embolism PE)。慢性期，則可能遺留不同程度的血栓形成后綜合征(post-thrombotic syndrome PTS)。近年來，

2、雖然針對DVT的治療已有長足的進步，但總體效果并不令人滿意。
　　生理情況下，血栓段靜脈血流的恢復(fù)主要是通過血栓的機化再通，多種細胞參與其中，其中內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）作為內(nèi)皮細胞的前體，具有定向分化為成熟內(nèi)皮細胞的功能，在血栓后的血管修復(fù)及血栓機化再通中起著重要作用，它可通過再內(nèi)皮化和新生血管形成來維持血管的平衡。我們前期關(guān)于DVT的系列實驗研究發(fā)現(xiàn)：1.骨髓來源的內(nèi)皮祖

3、細胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化為血管內(nèi)皮細胞；2.移植EPCs可以改善靜脈血栓內(nèi)的微環(huán)境，促進急性期血栓的溶解及慢性期血栓機化；3.由于移植到體內(nèi)的EPCs增殖能力及遷移歸巢能力較弱，從而減弱了EPCs的作用，限制了其在臨床上治療DVT中的進一步研究。因此，如何更好地調(diào)控EPCs的生物學(xué)功能，是目前相關(guān)研究的熱點。二甲雙胍是治療2型糖尿病的最

4、常用的臨床藥物之一，相關(guān)研究揭示：二甲雙胍可以（1）激活腺苷酸活化蛋白激酶-內(nèi)皮型一氧化氮合酶-一氧化氮（AMPK-eNOS-NO）通路，增加循環(huán)中的NO，從而保護血管內(nèi)皮細胞，減少DVT的發(fā)生率；另外它可以促進EPCs的動員，誘導(dǎo)血管新生；（2）激活腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-自噬（AMPK-mTOR-自噬）通路，增加EPCs細胞內(nèi)的自噬水平，提高EPCs在高糖和缺氧的環(huán)境中的存活率。但二甲雙胍對EPCs的生物學(xué)功能變

5、化影響并不清楚，是否有利于EPCs的分化、如何影響其遷移能力、成血管能力等研究未見相關(guān)報道。
　　本實驗首先通過密度梯度離心法分離出SD大鼠骨髓來源的單個核細胞（（Bone marrow-derived mononuclear cells，BMMNCs）），采用差速貼壁法，EGM-2 MV培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)培養(yǎng)擴增，得到的細胞經(jīng)形態(tài)、功能和細胞表面標志物鑒定證實為EPCs。其次對2-5代的EPCs進行不同濃度二甲雙胍處理，進行細胞形態(tài)

6、學(xué)觀察、免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測表面抗原標志物變化，經(jīng)CCK8法得到符合進一步實驗要求的二甲雙胍濃度；分組驗證AMPK在二甲雙胍促EPCs分化的作用，通過Western Blot、熒光實時定量 PCR等分子生物學(xué)方法分別探討 AMPK-mTOR-P70S6K信號通路、AMPK-mTOR-自噬信號通路以及AMPK-eNOS-NO信號通路的作用。接著采用劃痕試驗及Transwell試驗觀察經(jīng)二甲雙胍對EPCs的遷移能力的影響，采用成管試驗判

7、斷二甲雙胍對 EPCs成血管能力的影響，并通過檢測 MMP2、MMP、uPA及 VEGF的表達變化來探討相關(guān)機制。
　　體內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍可促進骨髓來源的EPCs的分化，這種調(diào)控作用可能與 AMPK-mTOR-P70S6K信號通路、AMPK-mTOR-自噬信號通路以及 AMPK-eNOS-NO信號通路相關(guān)；二甲雙胍能夠抑制骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞遷移及成血管功能，這可能與二甲雙胍能夠通過AMPK-mTOR-自噬信號通路來降低蛋

8、白酶MMP2和MMP9、uPA的表達相關(guān)。
　　上述研究結(jié)果為下一步的體外研究奠定了理論基礎(chǔ)，并可能為 EPCs移植治療DVT及缺血性疾病的臨床研究提供重要的實驗依據(jù)，為DVT的臨床治療提供新的思路和方法。
　　本實驗研究分為三部分，下面就研究目的、方法、結(jié)果、結(jié)論作如下分述。
　　第一部分大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法分離、培養(yǎng)和鑒定SD大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細

9、胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)，為后續(xù)研究提供合格的實驗細胞。
　　方法：密度梯度離心法分離SD大鼠骨髓來源的單個核細胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs），采用差速貼壁法結(jié)合含有多種生長因子的EGM-2MV培養(yǎng)基，定向誘導(dǎo)培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細胞，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)特征，CCK-8試驗對細胞不同時間段

10、的增殖特點進行分析并繪制生長曲線，免疫熒光聯(lián)合流式細胞技術(shù)對原代細胞進行鑒定，Dil-Ac-LDL與FITC-UEA-1雙熒光染色檢測細胞功能，免疫組化評估細胞分化程度。
　　結(jié)果：剛分離出的BMMNCs呈細小圓形，；培養(yǎng)24小時后體積增大，收集未貼壁的細胞重新接種到另一細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)至10天左右時細胞集落逐漸增大，此類細胞呈集落樣生長，起初時呈多邊形、梭形或卵圓形，具有較強的增殖能力，細胞逐漸融合，培養(yǎng)至第2-3

11、代的細胞呈典型的鋪路石樣生長。細胞形態(tài)學(xué)上符合典型內(nèi)皮祖細胞的特點。細胞生長曲線呈S形，細胞潛伏期一般為1～4天，培養(yǎng)后第5～11天到達對數(shù)生長期，第12～14天進入生長平臺期。雙熒光染色結(jié)果顯示：細胞具有吞噬DiI-ac-LDL并能結(jié)合FUTC-UEA-1的功能。CD34、CD133、VEGFR2流式細胞術(shù)同時檢測結(jié)果提示培養(yǎng)細胞符合 EPCs表面標志物的特性，抗 vWF免疫熒光染色細胞鑒定呈陽性。
　　結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合

12、差速貼壁法成功分離和培養(yǎng)了SD大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞，并聯(lián)合采用形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、免疫熒光及特異性細胞標志物來鑒定所培養(yǎng)細胞。結(jié)果表明，通過此方法可以得到純度較高、形態(tài)和功能學(xué)上均符合EPCs特點的細胞，能夠滿足后續(xù)實驗要求。
　　第二部分二甲雙胍對骨髓源性內(nèi)皮祖細胞分化的影響和相關(guān)機制研究
　　目的：探討二甲雙胍對骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞分化的影響及相關(guān)機制。
　　方法：1.將二代的EPCs給與不同濃度的二甲雙胍處理，進行

13、細胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測表面抗原標志物變化，CCK8法觀察對EPCs增殖影響較小二甲雙胍濃度。2.驗證AMPK在二甲雙胍促EPC分化的作用：將實驗分為四組：A：正常對照組、B.1mM二甲雙胍組、C.AMPK抑制劑Compond C（CC)組、D.1mM二甲雙胍+CC組，Western Blot檢測AMPK、P-AMPK、P-mTOR、P70S6K的表達情況。3.驗證eNOS-NO在分化中的作用：細胞分為四組：正常對照組、

14、1mM二甲雙胍組、一氧化氮合酶抑制劑L-NAME組、1mM二甲雙胍組+一氧化氮合酶抑制劑L-NAME組，檢測各組中p-eNOS表達變化，亞硝酸鹽法檢測培養(yǎng)液上清中NO含量。4.研究自噬在EPCs分化中的作用：正常對照組、1mM二甲雙胍組、自噬激動劑Rapamycin組、Atg5 siRNA干擾組、Atg5 siRNA干擾后應(yīng)用1mM二甲雙胍組；檢測Atg5、LC3B、P62等自噬指標的表達情況。
　　結(jié)果：1.二甲雙胍對EPCs的

15、增殖起著抑制作用，并隨著濃度的增加抑制作用逐漸增加，其中當二甲雙胍在1mM時對EPCs的增殖影響最?。慌c正常組比較，二甲雙胍組EPCs的體積增大，以長梭形為主，折光性增強，輪廓明顯，其 vWF表達增加，VEGFR2及CD31陽性率增高，CD33及CD34陽性的細胞數(shù)減少；vWF及CD31的mRNA基因表達升高；2.與正常組相比，二甲雙胍組EPCs內(nèi)AMPK磷酸化水平增加，磷酸化mTOR及P70S6K蛋白表達水平降低；特異標記分子vWF及

16、CD31基因表達增強；Compound C組EPCs的 AMPK磷酸化水平相對減少，而磷酸化的mTOR及P70S6K蛋白表達水平升高；特異標記分子vWF及CD31基因表達降低。3.檢測結(jié)果提示：與正常組比較，二甲雙胍組中EPCs的磷酸化eNOS表達增強，細胞培養(yǎng)上清中NO含量增加；vWF及CD31的表達上升；而L-NAME組EPCs的磷酸化eNOS表達降低，細胞培養(yǎng)上清中NO含量減少，vWF及CD31的表達降低。4.二甲雙胍和雷帕霉素都

17、可以上調(diào)Atg5和LC3B的表達，同時降低P62的表達，但上調(diào)vWF及CD31的水平較二甲雙胍組低?；蚯贸允上嚓P(guān)基因 Atg5可降低二甲雙胍引起的內(nèi)皮細胞特異標記分子vWF及CD31表達變化。
　　結(jié)論：1.二甲雙胍抑制EPCs的增殖，1mM濃度的二甲雙胍對EPCs的增殖影響最??；2、二甲雙胍促進 EPCs分化為成熟內(nèi)皮細胞，其作用機制與信號通路AMPK-mTOR-SP70S6K、AMPK-mTOR-自噬以及AMPK-eNOS

18、-NO相關(guān)。
　　第三部分二甲雙胍對骨髓源性內(nèi)皮祖細胞遷移及成血管功能的調(diào)控和相關(guān)機制研究
　　目的：探討二甲雙胍對內(nèi)皮祖細胞遷移和成血管能力的影響，并探討其可能的機制。方法：1.通過劃痕試驗及侵襲試驗，評估正常對照組與二甲雙胍組（1mM）對 EPCs遷移功能的影響；2.通過成管試驗評估正常對照組與二甲雙胍組（1mM）對 EPCs成血管功能的影響；3.PCR檢測正常對照組與二甲雙胍組（1mM）EPCs內(nèi)MMP2、MMP9和V

19、EGF、uPA的表達變化。4.評估AMPK-mTOR-自噬途徑的作用機制：將實驗分為四組：A：正常對照組、B.1mM二甲雙胍組、C.AMPK抑制劑Compond C（CC)組、D.1mM二甲雙胍+CC組，Western Blot檢測AMPK、P-AMPK、P-mTOR、MMP2、MMP9、VEGF、uPA、P62、LC3B的表達情況。
　　結(jié)果：1.二種試驗均發(fā)現(xiàn)：二甲雙胍組EPCs向劃痕區(qū)遷移的細胞數(shù)及遷移到Transwell小

20、室膜下層面的細胞數(shù)明顯低于正常對照組；2.二甲雙胍組EPCs形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目較正常對照組明顯減少，但管狀結(jié)構(gòu)的長度兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；3.二甲雙胍能顯著下調(diào)EPCs中MMP-2、MMP-9、uPA的表達，而VEGF的表達上調(diào)；4.二甲雙胍組EPCs中的AMPK磷酸化水平升高，相對應(yīng)的磷酸化的mTOR、MMP2、MMP9、uPA、P62蛋白表達降低，而VEGF和LC3B蛋白表達升高。
　　結(jié)論：二甲雙胍能夠抑制體外培養(yǎng)的骨髓來源