無感染增強(qiáng)的廣譜抗登革病毒中和抗體的構(gòu)建及機(jī)制研究.pdf

1、登革病毒是黃病毒屬、有包膜的單正鏈RNA 病毒，根據(jù)其包膜的抗原性不同，分為四種血清型（DENV1-4），主要以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。臨床上主要引起登革熱（Dengue Fever，DF）、登革出血熱（Denguehemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）。其中，DF是自限性發(fā)熱性疾??；而DHF/DSS 則引發(fā)血管通透性顯著增加，

2、導(dǎo)致血漿滲漏引發(fā)休克，嚴(yán)重威脅患者的生命。世界上約有半數(shù)的人口生活在登革熱疫區(qū)，每年有超過5000萬的感染病例，其中有50萬人發(fā)展為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征。
　　 但是，臨床上缺乏預(yù)防和治療DENV 感染的有效疫苗和藥物，主要以對癥支持治療為主?；谂R床上針對DENV 感染無有效防治手段的現(xiàn)狀，治療性抗體策略獲得了廣泛關(guān)注。大量體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明：中和抗體能有效阻止DENV的感染，不僅能發(fā)揮病毒感染前的預(yù)防作用，而且在病

3、毒感染后的一段時期內(nèi)，依然能發(fā)揮治療病毒感染的作用。
　　 DENV基因組編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白C，膜結(jié)合蛋白M和包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中，包膜E蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于成熟病毒顆粒表面，排列成平行二聚體結(jié)構(gòu)，構(gòu)成病毒顆粒的主要突起。E蛋白在空間結(jié)構(gòu)上形成3個不同的結(jié)構(gòu)域（ED1，ED2和ED3），其中，第3個結(jié)構(gòu)域（ED3）介導(dǎo)了病毒與靶細(xì)胞的

4、吸附，包含最重要的中和表位。
　　 但是，E蛋白上中和性表位知之甚少，同一血清型登革病毒內(nèi)不同基因型病毒株之間的差異對抗體保護(hù)作用的影響也還有待于進(jìn)一步分析。這些問題都阻礙了登革病毒致病機(jī)理的闡明及防治手段的開發(fā)。因此，確定登革病毒E蛋白的中和性表位，闡明抗體中和作用的機(jī)制，進(jìn)一步探討病毒致病性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基，不僅能促進(jìn)對其致病機(jī)制的了解，也為登革熱的防治提供重要信息；無論從DENV 發(fā)病機(jī)理，還是研發(fā)疫苗和治療藥物，都具

5、有重要意義。
　　 在登革病毒致病機(jī)制及其抗體治療策略的研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)性非中和抗體以及亞中和濃度的抗體能夠通過抗體的Fc 段產(chǎn)生抗體依賴的感染增強(qiáng)作用（ADE），進(jìn)而促進(jìn)疾病的進(jìn)展，這種現(xiàn)象阻礙了疫苗和單克隆抗體在登革熱及其他相關(guān)病毒防治中的應(yīng)用。登革熱常發(fā)生幾種血清型的交叉感染，因此，抗體要應(yīng)用于治療，必須能同時對四種血清型病毒均能產(chǎn)生有效的保護(hù)?，F(xiàn)有的強(qiáng)中和活性的單克隆抗體，多為單個型或只針對少數(shù)幾個型的單克隆

6、抗體，雖也有多株交叉反應(yīng)性抗體，但針對不同血清型病毒的保護(hù)效價不一；而幾種抗體的混合應(yīng)用又存在成分復(fù)雜以及需進(jìn)行多次臨床試驗(yàn)的問題。雙可變區(qū)抗體技術(shù)（Dual-Variable-DomainImmunoglobulin, DVD-Ig）可以通過將2株不同抗體可變區(qū)構(gòu)建于一株抗體分子上并保持原有抗體的親和力和保護(hù)活性，大大簡化了多株抗體混合應(yīng)用帶來的麻煩；獲得的抗體可進(jìn)一步經(jīng)過基因工程改造，將抗體的Fc 斷改造以消除ADE。在針對四種血清

7、型登革病毒的抗體治療過程中，通過將只針對幾個型的具有強(qiáng)中和活性的單克隆抗體進(jìn)行重新構(gòu)建，可獲得同時針對四種血清型登革病毒具有廣譜中和活性的雙可變區(qū)抗體。
　　 本項(xiàng)研究旨在利用雜交瘤篩選技術(shù)篩選獲得具有中和活性的單克隆抗體，驗(yàn)證其體內(nèi)外中和活性，進(jìn)一步分析登革病毒ED3蛋白的中和表位，明確了抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，初步闡明其中和作用的機(jī)制；進(jìn)一步采用基因工程方法構(gòu)建嵌合抗體及無ADE 活性的廣譜中和性抗體。研究主要包括四個部分：

8、r>　　 一、登革病毒ED3 區(qū)特異單克隆抗體的制備及功能鑒定我們以重組串聯(lián)的四種血清型登革病毒ED3蛋白作為免疫原，采用常規(guī)方法建立分泌針對登革病毒ED3 區(qū)的雜交瘤細(xì)胞系。最終獲得了14株登革病毒ED3 區(qū)特異單抗（1B12、1E12、1G6、1H8、2F9、2G9、2H12、3A10、3H12、4H10、5C10、6E1、6H7和7G5）。
　　 為了對這14株單抗所針對的病毒進(jìn)行鑒定，我們以四種血清型病毒感染的BHK細(xì)

9、胞制備的抗原片對其進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果證實(shí)，這14株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗均特異性針對登革病毒，對其他黃病毒屬成員不具有交叉反應(yīng)；14株單抗對不同血清型登革病毒的交叉反應(yīng)測定結(jié)果顯示，1B12、1E12、2H12、3A10、5C10、6H7和7G5是登革1型病毒特異的單抗；1H8和2G9為登革3 型病毒特異單抗；1G6為登革4 型病毒特異單抗；2F9 可交叉結(jié)合登革1、3 型病毒；3H12和4H10可交叉結(jié)合1-3 型登革病毒；6E1

10、可交叉結(jié)合四種血清型病毒。上述結(jié)果表明，我們獲得了ED3結(jié)構(gòu)域特異的針對四種血清型登革病毒的單抗，為ED3蛋白的抗原表位分析、登革病毒的診斷以及新型疫苗和抗病毒藥物研究提供重要信息和工具。
　　 采用蝕斑中和減少試驗(yàn)檢測這14株登革病毒特異單抗的體外中和活性，獲得一株登革4 型病毒特異的中和抗體；其次，對體外有中和活性的單抗采用乳鼠顱內(nèi)保護(hù)模型觀察其體內(nèi)保護(hù)作用。結(jié)果顯示，其中一株特異性針對登革4 型病毒的單抗1G6具有較強(qiáng)的體

11、外中和活性和體內(nèi)保護(hù)作用，單一50μg 劑量的抗體可以可在登革4 型病毒感染4h和24h后分別使90％和30％的小鼠存活，表明它對登革病毒的感染具有一定治療作用。
　　 為了確定中和抗體的作用機(jī)制，我們采用吸附前后蝕斑實(shí)驗(yàn)測定其在病毒感染周期中發(fā)揮作用的方式。結(jié)果顯示，1G6 主要通過抑制登革病毒與靶細(xì)胞的吸附來發(fā)揮中和作用；當(dāng)病毒與靶細(xì)胞吸附之后，其中和效價大大降低。二、中和表位的篩選與鑒定為了分析登革4 型病毒特異性中和抗體

12、的中和表位，我們首先采用噬菌體隨機(jī)12 肽庫對單抗1G6抗原表位進(jìn)行篩選獲得了其一致表位序列，并進(jìn)行了每5個氨基酸的系列缺失突變進(jìn)一步證實(shí)了肽庫的篩選結(jié)果。序列比對結(jié)果顯示，該單抗表位所對應(yīng)的多肽序列位于登革4 型病毒E蛋白第3 結(jié)構(gòu)域387LTLH390區(qū)域。在一級結(jié)構(gòu)上，登革4 型病毒E蛋白第388和390位氨基酸與登革1-3 型病毒ED3蛋白存在不同；
　　 從已有結(jié)晶的三維結(jié)構(gòu)上分析，發(fā)現(xiàn)，位于第390位的組氨酸，含有一

13、個與其它型登革病毒所不同的咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　 為了確定單抗1G6與E蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，我們進(jìn)一步進(jìn)行了定點(diǎn)突變并以間接ELISA 方式測定不同氨基酸位點(diǎn)的突變對抗體結(jié)合力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)T388G和H390G 單獨(dú)突變時，單抗1G6與ED3蛋白的結(jié)合力有顯著下降；當(dāng)二者聯(lián)合突變時，其結(jié)合力完全喪失，表明登革病毒E蛋白T388和H390位是1G6與其結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　 三、嵌合抗體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性為了減弱鼠源

14、抗體的異源反應(yīng)及下一步構(gòu)建具有廣譜中和活性的雙可變區(qū)抗體，首先用5’ RACE 法獲得了鼠源抗體1G6的輕重鏈可變區(qū)序列，并全基因合成了具有交叉中和登革1-3 型病毒的抗體1A1D-2的輕重鏈可變區(qū)序列。在此基礎(chǔ)上，將輕重鏈可變區(qū)分別與人重鏈（IgG1）和輕鏈（κ）恒定區(qū)連接構(gòu)成全長人-鼠嵌合抗體后分別裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建了嵌合抗體輕重鏈的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418 壓力篩選獲得可穩(wěn)定分泌人-鼠嵌合抗

15、體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)證明，該抗體具有與親本鼠源抗體相同的抗原結(jié)合活性和體外中和活性，為下一步構(gòu)建雙可變區(qū)中和抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　 四、無ADE 活性的雙可變區(qū)抗體的構(gòu)建及功能鑒定采用基因工程技術(shù)，以overlap PCR的方式將單抗1A1D-2和1G6的輕重鏈可變區(qū)序列分別以9個氨基酸的linker 進(jìn)行前后連接，構(gòu)建成DVD1A1D-1G6-VL、DVD1G6-1A1D-VL和DVD1A1D-1G6-VH、DVD1G6-1A

16、1D-VH 片段，分別與人IgG1的輕重鏈恒定區(qū)連接后裝入表達(dá)載體表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418 篩選獲得2種結(jié)構(gòu)的DVD抗體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，無血清大量培養(yǎng)及抗體純化，體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DVD1A1D-1G6的結(jié)合活性要優(yōu)于DVD1G6-1A1D。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，DVD1A1D-1G6抗體保持了雙價抗體的體內(nèi)外中和活性，實(shí)現(xiàn)了抗病毒譜的擴(kuò)大，具有抗四種血清型登革病毒活性。進(jìn)一步將介導(dǎo)ADE 效應(yīng)的Fc 段缺失突變

17、后，其ADE 活性消失，同時Fc 段的突變對其中和活性無明顯影響，表明我們成功構(gòu)建了具有廣譜抗登革病毒的無ADE中和抗體。
　　 本研究篩選獲得了14株登革病毒特異單克隆抗體，其中一株新型登革4 型病毒特異性中和抗體，發(fā)現(xiàn)了新的E蛋白功能表位，為闡明E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、登革病毒致病和免疫的分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)；進(jìn)一步構(gòu)建獲得了無ADE 活性的可同時中和四種血清型登革病毒的雙可變區(qū)抗體，為研制抗登革病毒新型抗體藥物作出了探索和提