重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡的構(gòu)建及免疫效能研究.pdf

1、登革病毒(Dengue virus, DV)為有包膜的單正鏈RNA病毒,黃病毒屬成員,以埃及伊蚊和白蚊伊蚊為媒介廣泛流行于熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)。引起人類感染的登革病毒共有4種血清型,其所致的登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。全球有25~30億人生活在登革熱流行區(qū)內(nèi),每年有1億以上的人遭受感染,其中約100萬人會發(fā)展成更為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合癥,死亡率5~20％。我國東南沿海是登革熱的重點流行區(qū)域,每

2、年都有爆發(fā)流行,且隨著全球人口流動及蚊媒遷徙,登革熱將越來越成為我國的公共衛(wèi)生問題。目前對登革熱尚未有效的防治措施,疫苗是預(yù)防和控制登革熱的有效手段,以往的登革熱疫苗研究主要集中在單一血清型別,效果單一;或?qū)?種型別DV的某一肽段串聯(lián)在一起,分子量大,結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不完整,效果不佳;尤其是 DV存在抗體依賴的感染增強現(xiàn)象(Antibody-dependent enhancement, ADE),即感染一種血清型DV后,機體產(chǎn)生的抗體(主要是非

3、中和抗體)在另一血清型DV感染時可導(dǎo)致感染增強,引起嚴(yán)重的出血熱,故迄今尚無安全、可靠的登革疫苗上市。
　　課題組前期對4種型別DV的抗原進(jìn)行了表位分析,以DV抗原分子之中和表位集中的包膜 E蛋白 III區(qū)為基礎(chǔ),采用氨基酸簡并機制,設(shè)計、篩選并制備了一組抗原分子,動物實驗表明能刺激機體產(chǎn)生高滴度(1:204800)的保護(hù)性抗體,動物保護(hù)率>95%。在此基礎(chǔ)上獲得了一條具有交叉保護(hù)功能的候選疫苗分子(DV-EDIII),經(jīng)初步細(xì)胞

4、和動物保護(hù)實驗證明 DV-EDIII對不同血清型登革病毒感染有交叉保護(hù)作用,減少了 ADE發(fā)生(已申報發(fā)明專利201110300602.3),但如何選擇合適的疫苗載體來呈遞DV-EDIII是接下來需要思考的問題。
　　細(xì)菌膜泡(membrane vesicles, MVs)是以出芽方式從細(xì)菌表面分泌的球形雙層膜結(jié)構(gòu),直徑20-200nm不等,是細(xì)菌分泌胞外因子的重要機制之一。作為新的疫苗遞送系統(tǒng),不僅能將有效抗原表位呈現(xiàn)在膜泡表面

5、,模擬天然病毒誘發(fā)機體的保護(hù)性免疫,同時膜泡為細(xì)菌在生長過程中自然分泌,具有穩(wěn)定,高效等優(yōu)勢。近年來,革蘭陰性菌的膜泡作為新的疫苗傳遞載體在預(yù)防腦膜炎、細(xì)菌性痢疾、肺結(jié)核等流行性疾病方面得到廣泛關(guān)注,腦膜炎奈瑟菌膜泡疫苗的應(yīng)用更證實了細(xì)菌膜泡作為疫苗載體使用的前景,雖然膜泡誘發(fā)的機體免疫保護(hù)機制尚未了解清楚,但這種免疫保護(hù)與膜泡攜帶傳遞的一種或多種抗原刺激機體產(chǎn)生的免疫力有關(guān)。2009年Lee等人證實革蘭陽性菌也能產(chǎn)生細(xì)菌膜泡,如果能使

6、用革蘭陽性菌膜泡作為疫苗組分的遞送系統(tǒng),既可避免革蘭陰性菌熱原質(zhì)LPS的影響,也可將外源基因插入膜泡攜帶主要抗原基因中,形成融合蛋白并隨膜泡分泌,從而達(dá)到制備多種疫苗乃至多價疫苗的目的。本課題利用新近發(fā)現(xiàn)的革蘭陽性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的膜泡分泌機制,通過基因重組技術(shù)將課題組前期設(shè)計合成的登革病毒保護(hù)性抗原分子 DV-EDIII插入到金黃色葡萄球菌膜泡攜帶蛋白中,通過金黃色葡萄球菌的膜泡分泌,制備登

7、革熱膜泡疫苗,并對其免疫效能進(jìn)行研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.金黃色葡萄球菌膜泡的制備及DV-EDIII融合靶蛋白分子的篩選
　　常規(guī)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌 RN4220,對培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾,使體積縮小至原體積的1/6,然后超高速離心獲得細(xì)菌膜泡的粗純產(chǎn)物,然后通過密度梯度離心法對膜泡作進(jìn)一步純化,獲得細(xì)菌膜泡。透射電鏡觀察,證實所制備的膜泡直徑為20-200nm,圓形或橢圓形,膜泡結(jié)構(gòu)。通過SDS-PAGE對制備的膜

8、泡進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌膜泡攜帶有多種蛋白成分,選取其中豐度較高的條帶(5條),切膠進(jìn)行質(zhì)譜分析,篩選出膜泡攜帶的金黃色葡萄球菌編碼的丙酮酸脫氫酶β亞單位(PdhB,分子量37kDa)作為登革病毒EDIII抗原插入的靶蛋白分子。
　　2.重組登革病毒EDIII膜泡產(chǎn)生工程菌的構(gòu)建
　?、俳瘘S色葡萄球菌 RN4220-EDIII+工程菌的構(gòu)建:為將登革病毒具有保護(hù)功能的簡并序列DV-EDIII插入金黃色葡萄球菌PdhB的

9、羧基端,使之與PdhB形成融合蛋白并隨細(xì)菌膜泡分泌。本課題利用同源重組原理,以金黃色葡萄球菌RN4220基因組中pdhB基因的鄰近序列為靶標(biāo),設(shè)計同源重組左、右臂,利用 PCR擴增獲得左、右同源臂,再用 PCR從 pSET16質(zhì)粒中擴增含氯霉素抗性基因的片段,從 pET22b-EDIII質(zhì)粒中擴增DV-EDIII簡并序列。運用重疊延伸PCR方法,獲得“同源左臂-EDIII-氯霉素抗性基因-同源右臂”全長敲入片段,插入大腸埃希菌-金黃色葡

10、萄球菌穿梭質(zhì)粒pYT3,構(gòu)建同源敲入質(zhì)粒pYT3-EDIII。應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將pYT3-EDIII轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌RN4220感受態(tài),并根據(jù)pYT3質(zhì)粒的溫敏特性,篩選具有氯霉素抗性的克隆,提取基因組,采用PCR和核酸測序鑒定均表明登革病毒簡并EDIII序列與金黃色葡萄球菌的pdhB基因融合正確。Western blot鑒定顯示EDIII-PdhB融合蛋白不僅可以在細(xì)菌菌體中正確表達(dá),并可通過膜泡分泌機制釋放到胞外,將這種能分泌含 D

11、V-EDIII膜泡的重組金黃色葡萄球菌命名為RN4220-EDIII+。
　?、赗N4220-Δagr/EDIII+工程菌的構(gòu)建:在獲得 RN4220-EDIII+工程菌后,利用該菌制備了細(xì)菌膜泡,在動物免疫過程中發(fā)現(xiàn)注射50μg/只的小鼠會死亡,表明膜泡有較強的毒力。為降低重組登革熱膜泡的毒力,提高膜泡使用的安全性,我們設(shè)計并敲除了 RN4220-EDIII+工程菌中調(diào)控細(xì)菌毒力的附屬調(diào)節(jié)基因agr,并觀察了agr敲除后工程菌產(chǎn)

12、生膜泡的毒力變化。首先以構(gòu)建的RN4220-EDIII+工程菌基因組為模板,用PCR分別擴增其agr基因的上、下游約900bp片段,將上下游片段直接連接(中間不含agr編碼基因)后插入穿梭質(zhì)粒pYT3,構(gòu)建敲除載體pYT3::Δagr,電轉(zhuǎn)化RN4220-EDIII+,利用pYT3的溫敏特性,篩選對四環(huán)素敏感的菌株,提取基因組, PCR驗證獲得 agr基因成功敲除的菌株,命名為RN4220-Δagr/EDIII+。制備RN4220-Δa

13、gr/EDIII+菌株的膜泡,按50μg/只劑量進(jìn)行小鼠攻毒實驗,結(jié)果顯示工程菌agr基因缺失后,膜泡的毒力大大降低,為后續(xù)制備安全穩(wěn)定的登革熱膜泡疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　3.重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡的免疫效能研究
　　①膜泡的制備:利用發(fā)酵罐培養(yǎng) RN4220-Δagr/EDIII+工程菌,分離培養(yǎng)上清制備細(xì)菌膜泡,經(jīng) BCA法測定膜泡的蛋白總量,結(jié)果顯示利用發(fā)酵罐制備的重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡產(chǎn)量約為23mg/

14、L。
　?、谀づ菝庖哐逯苽?采用腹腔、肌肉、皮下多點注射免疫6~8周齡Balb/c小鼠(50μg/只),免疫三次后采血,制備免疫血清,ELISA法測定血清的抗體效價。
　?、勰づ菝庖哐宓拿庖弑Ｗo(hù)性:通過間接免疫熒光實驗和病毒噬斑形成抑制實驗檢測膜泡免疫血清對vero細(xì)胞的攻毒保護(hù)作用,結(jié)果顯示膜泡免疫血清在1:20~1:40時能夠完全阻斷登革病毒對vero細(xì)胞的感染,隨著抗體稀釋度升高,對 DV-2的中和能力下降,但在抗

15、體稀釋度為1:320時,仍能保護(hù)約60%的細(xì)胞免受DV-2的感染,表明重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡免疫血清具有較好的保護(hù)效果。
　　綜上所述,本文通過基因重組敲入技術(shù)將課題組前期設(shè)計、合成的對登革病毒具有保護(hù)能力的抗原表位 DV-EDIII簡并序列成功融合入金黃色葡萄球菌 pdhB的3’-端終止密碼前,并可隨膜泡的分泌機制進(jìn)行分泌表達(dá);通過敲除登革熱膜泡產(chǎn)生工程菌的毒力調(diào)控基因 agr,降低了膜泡的毒力,提高了重組膜泡的安全性。